PCR - REAZIONE a CATENA della POLIMERASI 1 1 x 109 PCR DNA E’ “IL” mezzo per produrre in vitro grandi quantità di una specifica sequenza di DNA, partendo da DNA estremamente complesso. Il principio a cui si ispira la PCR è la replicazione del DNA: REPLICAZIONE 5’ 3’ DNA stampo PCR Primer a RNA Nuovo filamento DNA polimerasi DNA stampo Primers a RNA 3’ Primer oligonucleotidico 5’ DNA polimerasi termostabile Nuovo filamento 5’ 3’

   Le FASI della PCR DENATURAZIONE: Allungamento (~ 70°C) Denaturazione (~ 95°C) Annealing (~ 60°C)    DENATURAZIONE: Il DNA viene denaturato mediante riscaldamento in provetta a ~ 92-95°C ANNEALING: La miscela viene raffreddata fino a raggiungere la temperatura che garantisce la specifica ibridazione dei primers alle regioni dello stampo ad essi complementari ALLUNGAMENTO: La temperatura della miscela viene portata a 68-72°C consentendo alla DNA polimerasi termostabile di sintetizzare il filamento complementare allo stampo a partire dall’innesco oligonucleotidico

PCR I°step III°step II°step regione di interesse 5’ 3’ primer 1 primer 2 i filamenti vengono separati ed i primers si appaiano i primers si estendono complementarietà al primer 1 complementarietà al primer 2 filamenti di lunghezza omogenea filamenti di lunghezza variabile regione di interesse I°step II°step III°step Frammenti desiderati (quelli di lunghezza variabile non sono mostrati) E così via

Numero di copie di DNA contenenti il frammento desiderato I primi 4 cicli della PCR in dettaglio DNA stampo Frammento desiderato 1° ciclo 2° ciclo 3° ciclo 4° ciclo 35° ciclo Amplificazione esponenziale 21 = 2 22 = 4 23 = 8 24 = 16 235 Numero di copie di DNA contenenti il frammento desiderato Numero di copie di DNA della corretta lunghezza contenenti il frammento desiderato 2 8

     ~ PROGETTAZIONE dei PRIMERS Caratteristiche di un buon primer: Una sequenza di 16 bp sarà statisticamente presente solo una volta ogni 416 bp (~ 4 miliardi di basi) corrispondenti circa alla grandezza del genoma umano. Lunghezza: 16 bp o più   La Tm dipende dalla lunghezza e dalla sequenza del primers Tm = 4(G+C)+2(A+T)°C ~ 2-5°C al di sotto della più bassa Tm dei due primers usati T annealing  Tm primer 1 Tm primer 2 ~  Se la Ta dei due primers è molto diversa si possono verificare amplificazioni asimmetriche o a singolo filamento. Assenza di sequenze ripetute invertite che possano far ripiegare il primers su se stesso o di sequenze complementari fra i primers che causano l’amplificazione di dimeri dei primers 

PROGETTAZIONE “COMPUTERIZZATA” dei PRIMERS rev for 3314 842 425 Primer FOR Primability of Match = 100% Stability of Match = 82% GGACACGTATGCCACAGCCC TGCTAAATTTTCCAGCTAGGTAGCAGGACACGTATGCCACAGCCCTTAAAAGCATATCTGCACATGTCTT 1442 1461 5’- -3’ 2264 2281 CATGCATGATGCTCAAATGCCGCATTGTTGCGCTGTACGCACACATGTATGAATGCATGGCACGGATCAA GTTGCGCTGTACGCACAC -5’ 3’- Primer REV Primability of Match = 100% Stability of Match = 81% Primer REV Primability of Match = 71% Stability of Match = 44% GTGTGCGTACAGCGCAAC GGGTGGGACCTGGGCGCCCCCGCCGTGAGCGCCTACTGCTCCACCTGGGACGCCGGCAAGCCGTACTCG 1859 1876 5’- -3’

...PROGETTAZIONE “COMPUTERIZZATA” dei PRIMERS CTTTTGGCATAGACCACATGCCA 5’ TGTTACAAGTGTGGATGGATGCC 5’ Tm = 58.6 Tm = 56.1  GGCCAGTGAATTCAGCTCACGCCCCAAATATGCAGCTTCCAGTCCAGTTTCATCCGGCGCGCTGAAGATTTTTTAGAGCATGCTCTATTATGCAGCGTCCGTTGGAATGCTCTTTTTAACTCCGCGCGCGCTAAACTTGCGATTTTTTGGGCGCGGCGCTGATATTGGGCGTCTGTTGAAGATGCTCTTAAGTGGCCACAAGGGAGATGGGTCGGGCTAAGGTTTCATATCTTACAATATAAAGTTGAAGACGATTTGTGGCACCCAGGGGCGGGAGACGCATGCATGCAGCTGCATGATTGCACCAAGATCCGAAGAGTGGTTTATGGTTTGAGCTTAATTACTGCATGCATGCAACTTTTTGGTACAACTTTTGGCATAGACCACATGCCATCCCACCTCCCATGCTTTTCATTTTTACTTGTAAATTTGGATCTATTATATCTTTTGAATCAAAAGTTCAATTTATATTTCGTTTGCGTATTCTTGTCCCTTGTGTCGAGAGCTTTGAAACAAGCCCACTTTTGAATACGTTTTGACAAATTCTAAAAACTTAAGTGAGTTTCAACTGCTAAAACTTGATAGAATGAATGAAAAATTTAGCAAGTTTCAAAGACTAAAACTGAAACCCTAAGCCCTTAGCCCTAGATCCTAAGCCCTAAGCCGGAAGTCCTAAACCGTATGCCCCTAACA  Tm = 83.6 ? Clear Open file Calculate Minimum stem size: Minimum 3’ overlap: 4 2 Optimal annealing temperature is 56.7. 3’ end of oligo 1 pairs to positions 5 to 10 of itself.

COMPONENTI di una REAZIONE di PCR Stampo DNA a doppio filamento Deossiribonucleotidi trifosfati Miscela equimolare di dATP, dTTP, dGTP, dCTP Primers Oligonucleotidi complementari a regioni dei filamenti opposti che fiancheggiano la sequenza DNA bersaglio Tampone contenente cloruro di magnesio Lo ione Mg2+ è essenziale per il funzionamento dell’enzima Enzima Tradizionalmente viene usata la Taq polimerasi, enzima termostabile estratto dal batterio termofilo Thermus aquaticus dNTP Mg2+ COMPONENTI di una REAZIONE di PCR

I FATTORI CRITICI della PCR …nella miscela di reazione Non utilizzare quantità eccessive di stampo, primers e/o dNTP al fine di evitare amplificazioni non specifiche. Dosare accuratamente la [Mg2+] in funzione della quantità di stampo, primers e dNTP utilizzata  Mg2+ è indispensabile al funzionamento della Taq polimerasi, ma è chelato da stampo, primers e dNTP. Se in eccesso causa una perdita di fedeltà da parte dell’enzima. Selezionare l’enzima più idoneo alle proprie necessità Emivita alla temperatura di denaturazione Processività Capacità di correzione degli errori Taq, Pfu...

       I FATTORI CRITICI della PCR …nella programmazione ~ ~ 1’ TEMPERATURA e TEMPO di DENATURAZIONE 91-97°C a seconda della complessità dello stampo  Emivita Taq polimerasi: 30 min a 95°C ~ 30 cicli di denaturazione di 1 min Quindi, se: TDEN › 95°C o N. cicli › 30 Diminuire il tempo di denaturazione/ciclo  TEMPERATURA e TEMPO di ANNEALING NUMERO di CICLI Dipende da [stampo]iniziale 3x105 molecole iniziali  25-30 cicli 50 molecole iniziali 40-45 cicli N.B. Dopo 30-35 cicli: - l’attività dell’enzima si riduce - primers e dNTP si esauriscono TANN troppo bassa  amplificazione aspecifica  TANN troppo alta amplificazione con bassa resa 60°C 30’’ TANN ~ TMELTING o primers lunghi   Allungare il tempo di annealing 72°C 1’ TEMPERATURA e TEMPO di ALLUNGAMENTO TEMPERATURA: 68-72°C a seconda dell’enzima TEMPO: 1min / Kb di amplificato ALLUNGAMENTO FINALE di 7-10 min per completare la sintesi degli eventuali prodotti parziali

 STRATEGIE per AUMENTARE la SPECIFICITA’ TOUCHDOWN PCR PCR CLASSICA Den. 30 sec 94°C Ann. 30 sec Tm(+5°C) -1°C/ciclo All. 1 min/Kb 72°C 10 cicli Ann. 30 sec Tm(-5°C) 20 Den. iniziale 3-5 min 94°C 1 ciclo  All. finale 7 min 72°C Manteni-mento 4°C Den. 30 sec 94°C Ann. 30 sec Tm(-5°C) All. 1 min/Kb 72°C 30 PCR CLASSICA

 ...STRATEGIE per AUMENTARE la SPECIFICITA’ HOT START NESTED PRIMER PCR La PCR “hot start” previene la formazione di questi prodotti non specifici in quanto un componente chiave della miscela di reazione (enzima o MgCl2) viene aggiunto dopo lo step di denaturazione iniziale. Durante l’allestimento della reazione di PCR o durante il riscaldamento iniziale del campione si possono verificare situazioni di appaiamento non specifico fra primers e stampo. Fra 40 e 50°C la Taq polimerasi ha un’efficiente attività polimerasica e può estendere i primers non correttamente appaiati. Perché realizzare una PCR “hot start”? NOVITA’: Enzimi “Hot start” Gocce di cera Procedura: L’amplificazione è realizzata con un set di primers  Il prodotto è riamplificato con un set di primers interni ai precedenti I prodotti non specifici amplificati nella Ia PCR non saranno amplificati nella IIa 5’ 3’ Ia PCR IIa PCR pr. nested

Siti di clonaggio multiplo CLONAGGIO dei PRODOTTI di PCR La Taq e altre polimerasi hanno un’attività trasferasi-terminale che conduce all’aggiunta di un singolo nucleotide all’estremità 3’ dei prodotti di PCR. In presenza dei 4 dNTPs è preferenzialmente aggiunto dA. 5’ A-3’ 3’-A I prodotti di PCR possono quindi essere agevolmente clonati in plasmidi aperti che contengono un deossitimidin nucleoside (dT) alle estremità 5’. Siti di clonaggio multiplo  T T r

APPLICAZIONI della PCR Produzione di sonde oligonucleotidiche PCR Clonaggio e manipolazione dei geni Tipizzazione dei geni e del DNA: -caratterizzazione di ricombinanti batterici -diagnosi cliniche -analisi di campioni biologici in medicina legale Mutagenesi casuale o sito-specifica

 CLONAGGIO e MANIPOLAZIONE di GENI N.B. STRATEGIA Caso 1: Caso 2: Sequenza genica nota Caso 1: Caso 2: Sequenza genica omologa nota o sequenza proteica nota Si amplifica il gene desiderato direttamente dal DNA genomico o dall’’RNA Si disegna un primer specifico Si disegna un primer degenerato N.B. I primers possono essere disegnati in maniera tale da contenere al 5’ la sequenza di specifici siti di restrizione che possono essere sfruttati per l’inserimento dei prodotti di PCR nei vettori di clonaggio.  5’-TCGAATTCNCCYAAYTGNCC-3’ EcoRI Presentano varie opzioni a certe posizioni della sequenza rendendo possibile l’annealing e l’amplificazione di sequenze omologhe da organismi differenti Primers degenerati R = A, G H = A, C, T Y = C, T B = C, G, T W = A,T V = A, C, G M = A,C D = A, G, T K = G, T N o I= A, C, G, T S = C, G

5’ - RACE Rapid Amplification Complementary Ends Sintesi primo filamento cDNA AAAAA-3’ 7-mG Aggiunta coda omopolimera al primo filamento cDNA Trasferasi terminale + dATP Trascrittasi inversa + GSP1 GSP1 5’ 3’-AAAAAAAAA Sintesi secondo filamento cDNA mRNA TTTTT P complementarietà al primer P(dT) TTTT GSP1’ I° gruppo di amplificazioni 3’ AAAAA P’ II° gruppo di amplificazioni GSP2 GSP2’ Prodotto PCR finale

3’ - RACE Rapid Amplification Complementary Ends Sintesi primo filamento cDNA AAAAAAAA-3’ 7-mG Trascrittasi inversa + P(dT) mRNA TTTTT P Sintesi secondo filamento cDNA GSP1 complementarietà al primer P(dT) I° gruppo di amplificazioni 5’ 3’ AAAAA P’ GSP1’ GSP2 GSP2’ II° gruppo di amplificazioni Prodotto PCR finale

?   MUTAGENESI CASUALE R ER OR PRONE PCR ~ In che modo delle mutazioni nel gene influenzano la funzione del prodotto?  R ER OR PRONE PCR  PREMESSA: La frequenza di errore delle DNA polimerasi è ~ allo 0,001 ‰ (una base ogni 106 nucleotidi) grazie ad un’attività corretrice 3’ 5’ che rimuove i nucleotidi male incorporati. E’ possibile indurre l’aumento di errori nella PCR utilizzando: Taq polimerasi prive di attività correttrice Basse temperature di annealing che diminuiscono la fedeltà Ineguali concentrazioni dei dNTP Elevate concentrazioni di MgCl2 Alto numero di cicli (60-80) Amplificazioni successive del prodotto di PCR 

Denaturazione, rinaturazione MUTAGENESI SITO-SPECIFICA primer con differenza di un solo nucleotide sequenza bersaglio nucleotide originale nucleotide cambiato LEGENDA 3 4 2 1 PCR Filamento 1 Filamento 2 Filamento 3 Filamento 4 Denaturazione, rinaturazione DNA lineare amplificato DNA plasmidico circolare con incisure e nucleotide cambiato Trasformazione di E. coli

+ REAL-TIME PCR … on-line e in tempo reale! Amplificazione sequenza bersaglio + quantificazione dell’espressione genica identificazione del prodotto di amplificazione specifico rispetto a prodotti aspecifici analisi simultanea di due campioni nella stessa reazione individuazione di mutazioni puntiformi … on-line e in tempo reale! 

 LigthCycler SYSTEM  Caratteristiche: Roche Caratteristiche: Come mezzo di trasmissione della temperatura dalla resistenza ai campioni viene utilizzata l’aria che, essendo virtualmente senza massa, rende questo processo molto veloce. Le reazioni vengono preparate in capillari di vetro borosilicato che, avendo un alto rapporto superficie:volume, assicurano una rapida equilibrazione fra l’aria ed i componenti della reazione. Una reazione di PCR di 30-40 cilci può essere completata in 20-30 min. Rapide variazioni di temperatura durante i cicli termici   Monitoraggio on-line e simultaneo dell’amplificazione dei vari campioni mediante sistemi di rilevamento della fluorescenza

canali di rilevamento fluorimetrico ...LigthCycler SYSTEM resistenza capillari (max 32) camera termica filtri LED ventilatore canali di rilevamento fluorimetrico L’unità ottica è dotata di un LED come sorgente di luce e di tre canali di rilevamento che misurano la luce emessa a tre differenti lunghezze d’onda: 530nm 640nm 710nm I valori di fluorescenza rilevati vengono visualizzati sullo schermo del computer consentendo il monitoraggio on-line della reazione di PCR. L’intensità del segnale prodotto dal fluoroforo è proporzionale alla quantità del prodotto di PCR. Numero di cicli Fluorescenza L’aumento dell’intensità del segnale inizia a cicli differenti a seconda della concentrazione iniziale del DNA bersaglio.

L’AUMENTO DELLA FLUORESCENZA E’ REGISTRATO A 530nm SYBR Green E’ un colorante fluorescente che si lega solo al DNA a doppio filamento ed emette la fluorescenza solamente in queste condizioni. DENATURAZIONE Non viene rilevata fluorescenza L’intensità della fluorescenza comincia ad aumentare ANNEALING ALLUNGAMENTO L’intensità della fluorescenza continua ad aumentare e diventa massima al termine della fase di allungamento L’AUMENTO DELLA FLUORESCENZA E’ REGISTRATO A 530nm SYBR Green Primer Luce emessa Polimerasi

SONDE di IBRIDAZIONE Due sonde oligonucleotidiche sequenza-specifiche, marcate con coloranti diversi, ibridizzano con la sequenza bersaglio sul filamento di DNA amplificato in un arrangiamento testa-coda che consente l’emissione della fluorescenza. DENATURAZIONE Non viene rilevata fluorescenza: il colorante donatore è eccitato dalla sorgente ed emette energia in grado di eccitare l’accettore solo se la distanza fra i due è pari a 1-5 nucleotidi Colorante donatore Colorante accettore ANNEALING Viene registrata la massima fluorescenza L’AUMENTO DELLA FLUORESCENZA E’ REGISTRATO A 640nm Oligo 1 Fluoresceina Oligo 2 LC Red 640 Prodotto di amplificazione Eccitazione Emissione Trasferimento 1-5 nucleotidi

prodotti non specifici ANALISI della CURVA di MELTING Consente di identificare il prodotto di amplificazione specifico rispetto a prodotti aspecifici. Al termine della PCR la temperatura viene lentamente aumentata inducendo un decremento della fluorescenza. La temperatura in corrispondenza della quale si ha un repentino decremento della fluorescenza corrisponde alla Tm del prodotto. Curva di fluorescenza 0 10 20 30 40 50 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0  0.5 0 copie 10 copie 104 copie Fluorescenza Cicli di amplificazione 65 70 75 80 85 90 95 Temperatura (°C) 100 80 60 40 20 Curva di melting Derivata negativa della curva di melting -dF/dT TM prodotti non specifici

QUANTIFICAZIONE del PRODOTTO di PCR Identificando il primo ciclo della PCR in corrispondenza del quale inizia l’amplificazione esponenziale del prodotto è possibile quantificare la concentrazione iniziale del DNA bersaglio. 104 copie 105 106 Numero cicli Fluorescenza Curva di fluorescenza di campioni a concentrazione nota Estrapolazione della curva standard N. cicli Log concentrazione linea di base La linea di base identifica il ciclo in corrispondenza del quale inizia l’aumento esponenziale della fluorescenza per ciascun campione. Riportando in grafico il valore di intersezione con la linea di base in funzione del Log della concentrazione iniziale di ciascun campione si ottiene la curva standard da cui si può estrapolare il valore della concentrazione di campioni a titolo ignoto.

MULTIPLEX PCR Fluorecseina LC Red 640 LC Red 705 Consente l’analisi simultanea di due campioni nella stessa reazione Due coppie di Sonde di Ibridazione, ciascuna specifica per un prodotto di amplificazione, vengono marcate con un diverso colorante accettore che emette la fluorescenza a differenti lunghezze d’onda. STRATEGIA: Il segnale emesso viene letto simultaneamente attraverso due canali di rilevamento fluorimetrico. Canale 3 705 nm Canale 2 640 nm Eccitazione Trasferimento Emissione

ANALISI di MUTAZIONI PUNTIFORMI Sfrutta differenze nella Tm di Sonde di Ibridazione perfettamente legate al DNA bersaglio o il cui legame è destabilizzato dalla presenza di basi non appaiate. gene mutato La Sonda 1 si ibridizza alla parte della sequenza bersaglio mutata La Sonda 2 si ibridizza alla parte della sequenza bersaglio non mutata gene selvatico Sonda 1 marcata con Fluoresceina Sonda 2 marcata con LC Red 640 Al termine della PCR si analizza la curva di melting: se è presente una mutazione, la Tm dell’ibrido sarà più bassa che in assenza di mutazione. Temperatura 50 55 60 65 70 75 80 omozigote wildtype omozigote mutante eterozigote 3.0 2.5 2.0 1.5 Fluorescenza 50 55 60 65 70 75 80 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 -0.05 -dF/dT

L’ETICHETTATURA nei REGOLAMENTI C.E.E. Disciplina la vendita di prodotti contenenti OGM destinati al consumo umano ed introduce la nozione di sostanziale equivalenza : due alimenti sono considerati sostanzialmente equivalenti quando non presentano alcuna differenza dal punto di vista nutrizionale, organolettico e della sicurezza. Rende inoltre obbligatoria l’etichettatura degli alimenti transgenici che non siano sostanzialmente equivalenti ai prodotti convenzionali. REGOLAMENTO 258/97 sui Novel Food REGOLAMENTI COMUNITARI 49 E 50/2000 Prevedono l’obbligo di etichettatura per tutti gli alimenti che contengano ingredienti (49/2000), additivi e aromi (50/2000) derivanti da organismi geneticamente modificati. L’obbligo non vale se il prodotto risulti accidentalmente contaminato da derivati di organismi geneticamente modificati in una percentuale non superiore all’1%.

   DIAGNOSTICA degli OGM negli ALIMENTI TEST sulle PROTEINE Rilevazione immunologica della proteina codificata dal transgene (ELISA) - Quali- / quantitativo - Rapido - Test da campo Richiede materie prime non lavorate L’espressione delle proteine è spesso tessuto-specifica e sviluppo-dipendente - TEST sul DNA Ricerca del transgene e di sequenze ad esso correlate (Real-time PCR) - Sensibile (limite = 0.0001%) - Degradazione del DNA - Presenza di inibitori della polimerasi Possibili contaminazioni con DNA estraneo Non tutti i derivati alimentari contengono DNA (es. olio di semi di mais)

ITER per il RILEVAMENTO di OGM negli alimenti mediante TEST sul DNA Analisi qualitativa (screening) I° STEP Rivela la presenza/assenza dell’OGM nel campione Si ricerca la presenza di sequenze regolatrici comuni alla maggior parte degli OGM risultato positivo Si identifica il transgene presente, verificando se è uno di quelli autorizzati in commercio negativo L’analisi si arresta Nessun transgene autorizzato Alimento illegale Transgene autorizzato II° STEP Analisi quantitativa Se i singoli ingredienti superano la percentuale dell’1% scatta l’obbligo di riportarne la presenza in etichetta

  GENI BERSAGLIO nell’analisi qualitativa degli alimenti Elementi caratteristici dei costrutti ricombinanti Promotore CaMV 35S Transgene tNOS Gene marcatore PCR QUALITATIVA Amplificazione di una delle seguenti sequenze: Amplificazione di geni sicuramente presenti nel campione (es. lectina della soia, zeina del mais)   PCR QUANTITATIVA (è disponibile una banca dati che contiene tutte le sequenze di DNA depositate nei brevetti a livello mondiale) Individuazione del transgene

2 ESEMPI di QUANTIFICAZIONE... La soia Roundup Ready (Monsanto) è stata modoficata geneticamente per resistere alla somministrazione del glifosato, un diserbante ad ampio spettro. Soia Roundup Ready Per quantificare mais e soia transgenici negli alimenti sono state opportunamente disegnate combinazioni di Sonde di Ibridazione che riconoscono tanto il transgene quanto un gene endogeno, rendendo possibile quantificare simultaneamente sia il contenuto di mais/soia GM che di mais/soia totale nel campione in analisi. Sonda 1 specifica per il transgene cryIA(b), codificante per la tossina Sonda 2 specifica per il gene endogeno codificante per l’enzima invertasi Sonda 1 specifica per il transgene CP4-EPSPS Sonda 2 specifica per il gene endogeno codificante per la lectina Mais Bt di un gene che codifica per una tossina insetticida Il mais-BT è stato reso resistente alla piralide mediante l’inserimento derivata dal batterio Bacillus turingiensis la cui ingestione provoca la morte delle larve paralizzandone l’intestino. 2 ESEMPI di QUANTIFICAZIONE...