Laboratorio Professionalizzante di Spettroscopia Prof. Lorenzo Stella Settore 5 Livello 1 Stanza 4 Tel.: 06-7259-4463 E-mail: stella@stc.uniroma2.it

Eccitazione luminosa: La luminescenza Luminescenza: emissione di luce da atomi, molecole o cristalli eccitati elettronicamente. Eccitazione luminosa: Eccitazione chimica: Chemiluminescenza ~ns: fluorescenza ~ms: fosforescenza

Spettroscopia di fluorescenza: Informazioni ottenibili Concentrazione della sonda fluorescente (fluoroforo), fino a nM. Ambiente chimico ed accessibilità al solvente del fluoroforo. Dinamica dell’ambiente del fluoroforo. Dinamica conformazionale e diffusionale della (macro)molecola fluorescente (nei ps-ns). Numero e popolazione di specie presenti in soluzione. Distanza tra due fluorofori Vantaggi sperimentali Elevatissima sensibilità (fino alla singola molecola). Flessibilità di campionamento (anche misure “in vivo”). Basso costo e semplicità della strumentazione. Alcuni esempi: Processi di associazione, transizioni conformazionali, transizioni di fase, struttura di peptidi, dinamica di proteine, rilascio di farmaci, sensori e biosensori, pH intracellulare, imaging di cellule, etc. …

Il diagramma di Jablonski Conseguenze Stokes shift (spostamento ad energie più basse). Regola di Kasha (invarianza spettrale con la lunghezza d’onda di eccitazione). Regola dell’immagine speculare. Sensibilità alla dinamica.

Tempo di vita dello stato eccitato kr= costante di decadimento radiativo kn.r.= costante di decadimento attraverso i processi non radiativi N*= numero di molecole nello stato eccitato t I

Fluorofori Tutte le molecole assorbono. In fase condensata (solidi, soluzione) sono fluorescenti solo molecole con probabilità di transizione radiativa molto elevata: sistemi ad elevata coniugazione. Vantaggio per la sensibilità e la selettività della tecnica.

Il fluorimetro Beam splitter Lampada Campione lecc. lecc. Lente Monocromatore di eccitazione Lente Monocromatore di emissione Computer PMT “riferimento” PMT “segnale”

Osservabili: intensità Dipende da: Concentrazione di fluoroforo Efficienza dell’assorbimento di radiazione (e) Efficienza dell’emissione radiativa (resa quantica) Ecc. Em.

Osservabili: intensità e resa quantica L’intensità di fluorescenza è una misura relativa, perché dipende anche da: Intensità della lampada Efficienza dei monocromatori Banda passante utilizzata Sensibilità del tubo fotomoltiplicatore Ossia dipende dallo strumento con cui è stata determinata Al contrario, l’assorbanza è una misura assoluta [A=log(I0/I)] la resa quantica è una misura assoluta [=kr/(kr+knr)]

Filtro interno Ecc. Em. Ecc. Em. Campione diluito Campione concentrato

Assorbanza contro fluorescenza Inoltre: l’assorbimento è un processo istantaneo, la fluorescenza no sensibilità molto maggiore all’ambiente del cromoforo (processi non radiativi) Sensibilità alla dinamica.

Osservabili: spettro di emissione ecc. fissa. em. variabile. F in funzione di em..

Rilassamento del solvente Em. Ass. hn hn S0’ S0 H2O EtOH DMF c-Hex

Esempi

Osservabili: spettro di eccitazione em. fissa. ecc. variabile. F in funzione di ecc.. Se: unico fluoroforo F indipendente da ecc. (unico stato eccitato). A<<1 Allora F(ecc.) A(ecc.) Altrimenti: separazione dei diversi cromofori

Smorzamento della fluorescenza (quenching) Alcune molecole (quenchers), se si trovano in prossimità del fluoroforo eccitato, sono in grado di causare il suo decadimento non radiativo. Misurando l’efficienza di smorzamento della fluorescenza si può determinare l’accessibilità del fluoroforo al quencher.

1a Esperienza Spettri di assorbimento, emissione ed eccitazione. Intervallo di dipendenza lineare di F da C. Solvatocromismo Processi di associazione

6-propionil-2-(N,N-dimetilammino)naftalene Il fluoroforo: PRODAN d = 10 Debye c-Hex DMF EtOH H2O d = 2.8 Debye 6-propionil-2-(N,N-dimetilammino)naftalene (PRODAN)

Le ciclodestrine Molecole cicliche formate da unità glucopiranosio (6, 7, 8). Si ottengono per conversione enzimatica dell’amido.

Complessi di inclusione La struttura 3-D delle ciclodestrine è a tronco di cono, con una cavità apolare. In soluzione acquosa formano complessi di inclusione con molecole idrofobe. Questa proprietà viene utilizzata per modificare le proprietà della molecola ospite: solubilità volatilità tossicità resistenza alla biodegradazione. I complessi di inclusione hanno inoltre molteplici applicazioni in campo catalitico e separativo. Poiché la ciclodestrina è chirale, i complessi di inclusione sono enantioselettivi.

Complessazione ciclodestrina-PRODAN Applicazione: sensori a fluorescenza.