Lezione 19-20 IngGen 5-XII-06 Pcr quantitativa competitiva (competitori) Real time e LC

PCR quantitativa Come si può quantificare ? Si possono determinare dei valori assoluti ? Che metodologie si possono utilizzare ? PCR classica chiamata “end point” o terminale o meglio di fine* reazione (fine* inteso come finale senza giustificazione dei mezzi). analisi dell’amplicone dopo i cicli di fine* reazione, gel elettroforesi colorazione con Bromuro di Etidio o Cybrsafe (intercalante fluorescente del DNA, si rileva con UV) quantificazione comparativa, relativa. - PCR “real time” o “light cycler” automatizzata con lettura del prodotto della PCR direttamente durante i cicli di amplificazione tramite lettura laser della fluorescenza corrispondente alla quantità di DNA prodotto.

PCR competitiva competitore ottenuto con mutagenesi tramite PCR di un amplicone a seconda delle esigenze. Per poter fare un competitore dobbiamo sapere per cosa lo dobbiamo usare, se per PCR classica o se per “Real Time - LC. - inserzione di un frammento all’interno di un amplicone - si ottiene un competitore con peso molecolare diverso dal frammento w.t. con sostituzione di una sequenza La sequenza esogena inserita non deve avere omologie con il genoma e si utilizza come target della sonda per la quantificazione “Real Time - LC” oppure per discriminarla su gel.

Primers con la coda (3’ o 5’) Riguardiamo come si fa mutagenesi di un amplicone I primers con la coda si usano per creare omologie tra sequenze e favorire appaiamennti tra ampliconi diversi, bada al 5’ o 3’! SA2.5-A2 ggccggtaccGGATCCCGGTTCCTGATCACTG SA2.1-A2 ggccggtaccCTTCCTGCCAACCTGGGGGCTG SA2.5A ggccacgcgtGGATCCCGGTTCCTGATCACTG SA2.6A ggccacgcgtCCACAGTCACTGCCAGATGCTC SA2.1A ggccacgcgtCTTCCTGCCAACCTGGGGGCTG SA2.2B ggccacgcgtGGCTTTTGCCAGTCCTCCTAC SA.8A ggccacgcgtCGCTCGCTGCCCCACTCAGGAGG SA.9B ggccacgcgtCTCCTAGCAGGGTCTCCTCCCTGG A cosa possono servire delle code ? Se devo fare una mutagenesi posso adoperarle ? In che modo ? Come devono essere le code ? Quali requisiti devono avere ? Cerchiamo dove mappano a quali geni appartengono ?

PCR competitiva “end point” Quantificazione: confronto amplicone / competitore - valore relativo non assoluto fluorescenza osservata su gel con Et.Br.(bromuro di etidio) - diverso peso molecolare oppure su “Real time” con sequenza interna diversa riconoscibile da sonda specifica - competitore amplificato nella stessa reazione (fisicamente nella stessa provetta) - la quantificazione relativa misurata col rapporto tra la conc. (fluorescenza-luminanza) dell’amplicone e del competitore - determinazione da un numero ampio di diluizioni note del competitore, mantenendo costante la quantità di DNA del campione da quantificare.

Come si fa la PCR competitiva Perchè competitiva analisi della concentrazione del competitore e dell’amplicone le due sequenze competono per i primers Perché competono ? come è fatto il competitore ? È un “mutante dell’amplicone” per inserzione, mutaz. con PCR a 3 passaggi (vedi lez.15-16) amplicone w.t. 5’ 3’ 5’ 3’ pr frw pr rev 3’ 5’ 5’ 3’ seq mutata 5’ 3’ pr frw 3’ 5’ pr rev amplicone mutante 3’ 5’

Procedura competitiva reazione col DNA del campione in analisi ed il DNA del competitore. primers in comune amplificano i due diversi ampliconi. almeno 5 reazioni con 5 diluizioni del competitore e stessa concentrazione del DNA in analisi. In ogni provetta la quantità di DNA amplificata sarà proporzionale alla quantità iniziale del DNA dei due templati aggiunti alla reazione: il competitore ed il wt. competitore a concentrazione nota PCR messa a punto per assenza di amplificati spuri

gel PCR competitiva end point long amplicon 271bp Confronta le concentrazioni del competitore nei tre diversi esempi. Come si interpreta? compDNA mtDNA 300 bp compDNA dilut. x 10-6 6 9 15 18 27 48 60 medium amplicon 240bp compDNA mtDNA 300 bp si tratta di PCR nested compDNA dilut. x 10-5 3 6 9 15 18 27 48 60 short amplicon 146bp compDNA mtDNA 200 bp compDNA dilut. x 10-4 1 3 6 9 15 18 27 48 Come mai cambia il peso anche del competitore ?

Plot valori di fluorescenza gel PCR competitiva Come si ottengono i valori: ascissa = log conc in peso ordinata = log rapporto fluoresc corretto log. mtDNA/compDNA log. fmol x10-6 long medium short

gel di PCR competitiva II caso amplicone primers 146 bp Campione - I Confronta le concentrazioni del competitore nei tre esempi. Come si può spiegare ? 200 bp compDNA mtDNA compDNA dilut. x 10-6 9 18 27 36 48 60 Campione - II 200 bp compDNA mtDNA compDNA dilut. x 10-5 3 9 18 24 30 36 Campione - III 200 bp compDNA mtDNA compDNA dilut. x 10-4 3 6 9 18 27 48

Plot valori del II esempio log. mtDNA/compDNA log. fmol x10-6  -1 -0.5 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 MBM-I-II-III-IV ±S.E. MBM-I MBM_II MBM-IV MBM-III La concentrazione del competitore è stata determinata per assorbanza allo spettrofotometro a 260 nm lunghezza d’onda, 1 OD a 260 nm = 50  DNA / ml;  = microgrammi

Determinazione dei valori Analisi del gel PCR “end point” con transilluminatore ad UV ogni banda letta con telecamera per luminanza si determina l’area di una singola banda e si riporta su tutte le bande. si sottrae dalla luminanza di ogni singola banda la luminanza di una regione uguale ma senza DNA per determinare il valore di sottofondo (background che non è underground). si normalizza il valore della fluorescenza per la lunghezza del frammento dovuto al fatto che il competitore è più lungo dell’amplicone w.t. la fluorescenza è data da un intercalante e quindi a parità di concentrazione è proporzionale alla lunghezza del frammento, il competitore più lungo del frammento da quantificare avrà anche maggiore fluorescenza a parità di molecole.

determinazione dei valori II dopo i valori di fluorescenza di ogni singola banda determinare rapporto tra i valori del DNA dell’amplicone wt (in questo caso mtDNA bovino) e del competitore. frazione maggiore o minore di 1 se il mtDNA > competitore. - il punto di uguale luminanza tra i due DNA avrà il rapporto uguale ad 1. valore del rapporto dato come log in base 10 e quindi il punto di isomolarità (num. = denom.) sarà 0 un numero sufficiente di valori di diluizione del competitore può determinare una retta che incontrerà il valore 0 se le diluizioni hanno il competitore con la concentrazione che si inverte rispetto al campione in analisi. comp > mtDNA / comp < mtDNA

Cosa si deduce Dal primo esempio che abbiamo fatto si può dedurre che un DNA estratto da una matrice trattata ad alta temperatura 120°C è parzialmente degradato. La lunghezza media dei frammenti di DNA è intorno ai 150 nucleotidi e infatti si amplifica circa 10 volte meno un amplicone di lunghezza di 240 paia di basi e ancora 10 volte meno con 270 bp. Dal secondo esempio si deduce che le matrici trattate a temperatura crescente hanno un’amplificabilità diversa dovuta al trattamento termico. Tra 110 °C , 120 °C e 133 °C la misura media dei frammenti di DNA scende in maniera tale per cui tra la temperatura più bassa e la più alta la conc di frammenti di 146 bp amplificabili è circa 100 volte maggiore.

limiti del metodo Il limite di questo metodo: conc. bande visibili su gel, rischio saturazione del lettore a livello di luminanza, rischio sottovalutazione della concentrazione. 1! calibrazione reazione per ottenere un “range” di intervallo in cui i valori non vanno a saturazione. 2! diluizioni del competitore con l’inversione di quantità tra le concentrazioni del comp. con quelle del frammento wt. 3! la quantificazione non si può fare per estrapolazione, ma solo per interpolazione. Per intenderci bisogna che la retta dei valori del log.del rapporto wt / comp. passi per il valore 0.

PCR quantitativa Real Time e Light cycler - quantificazione non “end point” ma in fase logaritmica - non arriva a saturazione. assioma: proporzionalità della quantità amplificata a quella iniziale ad ogni ciclo (dal punto di superamento del sottofondo-background) un raddoppio ed in tre cicli si avvicinerà ad 1 log. questo metodo assume che si possa confrontare l’amplificazione del DNA di un campione di controllo a varie diluizioni col nostro campione in esame. Se vi ricordate con il saggio Northern si normalizza rispetto ad un mRNA “house keeping” per poter fare un confronto con questo metodo si quantifica con una curva standard.

Real time e Light cycler metodo e principi Confronto plausibile se è standard il sistema di estrazione dei campioni sempre dalla stessa matrice (per es. sangue come nel caso di determinazione di viremia o di livello di infezione da HIV o di qualunque altro patogeno). - esistono sitemi robotizzati di estrazione da sangue e di PCR successiva. - con estrazione automatica ed il tipo di campione costante il confronto tra PCR è plausibile (conc linfociti costante). - determinazione dei valori di varie diluizioni note dell’amplicone con i quali si costruisce una curva standard di riferimento. - Un algoritmo misura il rapporto tra incremento di fluorescenza e n. dei cicli - confronto rispetto alla curva standard = concentrazione

Assunzioni e possibilità di errore confronto tra quantità di DNA di due PCR diverse assunzione che le reazioni avvengano in maniera assolutamente ripetibile, campioni confrontati sono estratti dalla stessa matrice o: efficienze di estrazione del DNA uguali nei due campioni - DNA estratti con la stessa efficienza e protocollo Meglio se il metodo di estrazione è automatizzato e sempre sulla stessa matrice. Con questa premessa si può assumere che il confronto con una curva standard sia plausibile. Tutto al più se c’è un errore questo si ripercuoterà su tutti i campioni in quanto sono estratti e amplificati tutti nelle stesse condizioni automatiche. Se il metodo è manuale ogni analisi deve essere fatta in triplicato e valutato l’errore standard.

Calcolo della concentrazione La concentrazione del campione viene valutata interpolando il punto di inizio della fase logaritmica dell’ amplificazione determinato come il punto in cui lo strumento riesce a stabilire un aumento sopra al “background” confrontandolo con i punti della curva standard di riferimento. La curva standard avrà delle amplificazioni a tre cicli di differenza per ogni log di diluizione. Se all’interno di questi valori casca il punto di inizio della fase log. del campione, si può ricavare il valore della concentrazione dell’amplicone nel campione (come per esempio il virus nel sangue). Di solito è lo strumento che ha un algoritmo che fa il confronto con la curva standard che si è determinata, sta all’operatore vedere se il valore è interno o esterno alla curva medesima e valutare se acquisire il dato o ripetere la PCR con un’altra quantità di DNA adeguata.

Come funziona il metodo di determinazione a fluorescenza Sia il metodo Real time che Light Cycler funzionano con la determinazione diretta del DNA reso fluorescente o con colorazione aspecifica (SYBRgreen) o con primer fluorescente o con sonda fluorescente. I due metodi si basano su sistemi chimici diversi. Il meccanismo “Real time” (applied biosystems AB) non è diverso da un normale termociclatore (provette con 30-50 l) salvo il laser che legge l’assorbanza nei vari pozzetti con le provette, dovuta alla conc del DNA alla lunghezza d’onda della fluorescenza (nel visibile). Il meccanismo “Light Cycler” (Roche) è in provetta capillare (20 l totale) in un rotore in cui il lettore laser sta fisso rispetto a quello AB in cui si sposta per leggere nelle varie provette la concentrazione.

La chimica dei metodi fluorescenti Fluorescenza aspecifica con SYBRgreen (intercalante) Fluorescenza specifica sonda taqman Appl Biosyst (quencer e attività eso-nucleasica della TAQ) fluoroforo quencher sonda pr frw pr rev Fluorescenza con enhancer doppia sonda (Roche) FRET fluoroforo attivabile sonda enhancer primer rev

Metodo Taqman TaqMan probes are oligonucleotides that contain a fluorescent dye on the 5' base (typically) and a quenching dye on the 3' end. Taq esonucleasi idrolizza il quencher, fluoroforo emette

Metodo FRET fluorescence resonance energy transfer b c a a, ccitazione - b, passaggio di energia - c, emissione

ancòra FRET Se si amplificano due ampliconi La melting curve lo mostra

Ultima FRET

SCHEMA ESERCITAZIONE INGEGNERIA GENETICA 12 DICEMBRE 2006 1 PCR DNA Amplicone conetenente polimorfismo umano enhancer Ig - corsa elettroforetica GEL SYBRSAFE - osservazione TRANSILLUMINATORE a)preparazione della reazione a.1) preparazione mix di reazione a.2) aliquotazione o aliquotamento e aggiunta campioni DNA a.3) reazione PCR nel termociclatore con programma cicli b) caricamento del gel, corsa elettroforetica - valutazione dei genotipi osservati nel gel