Metodi di sequenziamento Sanger (enzimatico) Maxam e Gilbert (chimico)

Metodo di Sanger primer quattro dNTP (incluso 32PdNTP) DNA polimerasi ddTTP ddCTP ddGTP ddATP primer nuovo DNA dideossinucleotide terminatore La catena neosintetizzata termina quando un ddNTP è incorporato al posto di un dNTP Denaturare e separare su gel di poliacrilammide

Metodo di Maxam e Gilbert DNA singolo filamento marcato ad una estremità 4 o 5 reazioni di modificazione base-specifiche Es. metilazione delle G con dimetilsolfato Rottura del filamento in corrispondenza della base modificata mediante piperidina Separare i frammenti marcati su gel di acrilammide

Gel di poliacrilammide di sequenza

Confronto metodi di sequenziamento Sanger rapida e semplice attuazione disponibilità di kit necessità di primer sensibile a strutture secondarie Maxam e Gilbert lunga preparazione del DNA reazioni da mettere a punto relativamente economico strutture non influenti utilizzabile per oligonucleotidi

Sequenziamento automatico

Sequenziamento con Taq polimerasi

Trasferimento di acidi nucleici (Blotting) Southern Northern

Schema trasferimento

Schema ibridazione

Metodi di trasferimento Capillare Elettroblot

Assemblaggio del blot capillare vaschetta tampone carta 3MM carta 3MM } membrana nylon gel supporto

Assemblaggio dell’elettroblot membrana nylon carta 3MM gel spugnette - + tampone

Analisi di espressione con Northern blot

Altre tecniche di analisi Estensione del primer (primer extension) Protezione dalla S1/RNasi (mapping) RT-PCR

Estensione del primer mRNA totale cap mRNA globina 3’ 5’ oligo antisenso marcato ibridazione estensione con RT Analisi dei frammenti estesi su gel di sequenza frammento protetto

Protezione da RNasi (RNase Protection) mRNA totale sonda RNA antisenso mRNA globina cap 5’ 3’ ibridazione trattamento con RNasi Analisi dei frammenti protetti su gel di sequenza frammento protetto inizio trascrizione

Analisi interazioni DNA-proteine: saggio di footprinting

Analisi interazioni DNA-proteine: saggio EMSA

Sistemi di espressione In vitro (estratti cellulari) In vivo (cellule in coltura) Animali transgenici

Gene reporter

Trasformazione del lievito (Saccharomyces cerevisiae) diversi tipi di vettori vettori “navetta” batteri-lievito possibilità di ricombinazione omologa

Vettori di clonaggio per lievito

Ricombinazione omologa

Trasfezione di cellule in coltura transiente stabile vettori episomali

Vettore di espressione in cellule di mammifero

Trasfezione in cellule in coltura

Vettori episomali

Metodi di trasfezione fosfato di calcio liposomi (e simili) elettroporazione virus (SV40, retrovirus)

Descrizione generale esercitazioni di laboratorio Studio della localizzazione intracellulare della proteina SEC4 del lievito Saccaromyces cerevisiae Clonaggio di SEC4 in vettore per l'espressione in lievito di proteine di fusione con "tag" (GFP) Espressione di SEC4 in lievito e analisi della sua localizzazione mediante western blot di estratti frazionati Parte A 1) Isolamento di DNA genomico da lievito (I parte) 2) Isolamento di DNA genomico da lievito (II parte) Analisi spettrofotometrica del DNA preparato PCR su DNA genomico (preparazione frammento da clonare) 3) Preparazione di DNA plasmidico (vettore di clonaggio) con colonnina Digestione DNA (vettore e frammento) con enzimi di restrizione 4) Analisi su gel di agarosio Reazione con enzima "ligasi" 5) Preparazione piastre di agar Trasformazione batterica 6) Analisi risultati trasformazione Minipreparazione DNA plasmidico 7) Analisi su gel di agarosio 8) Fasi iniziali di Southern blot

Clonaggio con doppia digestione EcoRI HindIII  GAATTC CTTAAG  AAGCTT TTCGAA  AGCTT A G CTTAA  GAATTC CTTAAG AAGCTT TTCGAA DNA ligasi AATTC G A TTCGA EcoRI HindIII  GAATTC CTTAAG  AAGCTT TTCGAA

Trasfezione con liposomi

Elettroporazione

Vettori virali

Vettori retrovirali