Altre PCR: Mutagenesi e PCR inversa Lez 15_16 IngGen 28_XI_06 Altre PCR: Mutagenesi e PCR inversa A volte si clonano a volte ritornano [le PCR (i prodotti)]

Clonaggio dei prodotti PCR Clonaggio in plasmidi dedicati di prodotti PCR - TAQ polymerase w.t. produce aggiunte di A terminali spuri; - TAQ proof reading o altri producono ampliconi “blunt ends” - dal tipo di enzima si sceglie un plasmide adeguato. Esistono in vendita: - plasmidi gia’ linearizzati con coda di T terminale per facilitare la ligasi tra l’amplicone ed il plasmide - plasmidi con topoisomerasi coniugata all’estremita’ del plasmide che lega direttamente l’amplicone senza bisogno di ligasi

PCR inversa strategia Per amplificare le regioni limitrofe ad una regione nota - un modo diverso per fare gene-walking È necessaria: una sequenza nota una mappa di restrizione Scegliere il frammento di restrizione consono né troppo lungo (non si amplifica bene) né troppo corto (non da molta informazione)

PCR inversa metodo Preparazione del DNA da analizzare (genomico o cloni con parziali sequenze ignote - se non si conosce la mappa di restrizione analisi Southern - digestione del DNA preferibilmente con enzimi con tagli “protruding” - ligasi del frammento su se stesso - purificazione del frammento utile da gel eletroforesi - amplificazione con primers divergenti - con PCR si amplifica sempre un frammento lineare

si amplifica il frammento circolare PCR inversa Il nome deriva dal fatto che si usano primers disegnati su una sequenza con direzione divergente, direzione di sequenza dei primers apparentemente non convergente. Analisi Southern Frammento di DNA A B c d Sequenza nota (primers divergenti) Ligasi per circolarizzare il frammento si amplifica il frammento circolare nella regione ignota B A Sequenza nota primers divergenti C D

Orientamento primers PCR inversa ligasi del sito di restrizione a b 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ c d 3’ d c 5’ 3’ 5’ b a b a

PCR nested per PCR inversa estremità ignote digerite da DNA genomico e legate regione nota II primer II primer I coppia divergente I primers dovranno sempre essere complementari ai due diversi filamenti I amplicone II amplicone I primer II primer

Primo ciclo frgm + lungo frammento di restriz legato c c-d sequenza nota d I ciclo d c d c II ciclo d c c d c d possibilità di concatenamero se la taq prosegue

Mutagenesi tramite uso di primers modificati Per fare avvenire una delezione o inserzione si utilizza il metodo a tre passaggi (esempio per inserzione). pr.ext. frw. pr.int. frw. pr.int. rev. pr.ext. rev. 3PCR indipendenti pr.ext. frw. I pr. int. rev. II pr.int. frw. inserzione pr.ext. frw. pr.ext. rev. ( ) III ( ) pr.ext. rev. per inserire la sequenza mutata nella sequenza voluta o si seleziona un ricombinante dopo trasfezione o si inserisce direttamente la sequenza mutagenizzata con enzimi di restrizione.

Mutagenesi con PCR in tre passaggi DNA mitocondriale bovino acc. N. V00654, gi 12800 con 16338 bp L8014 (external forward primer) 5’-ACCCATTGTCCTTGAGTTAGT-3’, H8393 (external reverse primer) 5’-GAGGGTTACAAAGCGATTGCT-3’, H8242 (internal reverse primer) 5’-GAGATCTGCCGTACAGGCCTAGAATATTTTTGTTGGTGTCAGT-3’ and L8283 (internal forward primer) 5’-CTAGGCCTGTACGGCAGATCTCAAAACAAAACACCCCTTGAGA-3’, III PCR per estensione della regione sovrapposta I primers interni L8283 e H8242 hanno una coda al 3’-terminale che è stata usata per introdurre una inserzione di 22 bp (parte sottolineata nella sequenza del primer). La complementarietà sta nell’inserzione tra il 3’ dell’int. frw. primer ed il 5’ dell’int.rev.primer L’inserzione permette di discriminare per peso molecolare la sequenza bovina da quella del nuovo costrutto usato nella PCR competitiva come riferimento con varie diluizioni a partire da una concentrazione nota. Il competitore sintetico è stato clonato nel vettore pBlueScript KS+ della ditta Stratagene (La Jolla, Ca.CA USA).

Complementarietà delle code H8242 (internal reverse primer) 5’-GAGATCTGCCGTACAGGCCTAGAATATTTTTGTTGGTGTCAGT-3’ and L8283 (internal forward primer) 5’-CTAGGCCTGTACGGCAGATCTCAAAACAAAACACCCCTTGAGA-3’ seq mitoc. spec coda per appaiamento 5’-CTAGGCCTGTACGGCAGATCTCAAAACAAAACACCCCTTGAGA- 3’ 3’…………TTTTATAAGATCCGGACATGCCGTCTAGAG 5’ seq mitoc. spec 5’ 3’ int rev pr templato 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ int frw pr 3’ 3’ 5’ templato

appaiamento PCR I + II 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ X 5’ 5’ X “elongation” solo di due filamenti

inserzione di un frammento f in un amplicone (3 steps = 3 passaggi) I e II PCR f frw frw b a rev f rev annealing di 2 PCR f b a f III PCR in 2 fasi inserzione b frw a f rev

delezione di un frammento b da un amplicone a b c delezione 1 2 frw rev a b c delezione 3’libero oredil 3’ annealing II PCR

sostituzione in un amplicone in 3 passaggi a c b z I II 3’ 5’ I II II PCR separate z 3’ annealing II PCR ed “extension” a c 5’ 5’ 3’ z III a c z 3’ 5’ PCR finale

Applicazioni dell’ultimo metodo Questo terzo metodo che abbiamo visto, può essere utilizzato sia per ottenere inserzioni o sostituzioni, ma anche delezioni però con l’inserzione di un nuovo frammento di lunghezza diversa, anche molto diversa. Dipende da dove si fanno partire i primers interni con la coda. In realtà si possono giuntare anche frammenti non limitrofi per costruire geni di fusione. Si possono legare esoni di geni diversi come per esempio esoni di un gene a cui attaccare la GFP o Lac Z.

esercizio 1 CTCAGAGCTG GGAAGGAGGC TCTAGATGGC GGCTGTGCCT TAGAGAGAGC GCGCTCTGCT 61 CCCTGCCTTT GCCTCACTTT ACGCAACTTT CCCTAACTTT CGGGCAGCCT CAGGGGGCCC 121 CCGTAGCCCC CTGCCTTTCC TAGGGACTTA CTGGGGTCGA TTCGAACCTT TTTTTGGGAG 181 AAAAGCAGCT TTTAGGAGCT TTCTTTTCGT GCCTTGTTGG AAAGAAGCAG CCGTACTGAG 241 AGCCCAGGTC GTTGTTTTTT CCAGCTTAGA AGCCATGGCG CACCTCCATT TTTGTGCGCT 301 CTCCTAATGA GGTTTTTTTT CTTTCGGACC TGTTTTAGTA TTAATTATTG CTTTATTTTT 361 TTGACCAGTT AACATATTTG AGGGTTATTT TATTTATTTT TCGTTTTTTA ACGGAGGATT 421 TTGCCTTTAT TTTTAATTAT TTGGGATCTG ATATTTTTCT ACTAGTAGAT AGGACTCTTG 481 GTTTGGACAT ACTACATGGA TCAGTAAATA CCTGGGCACA GGACTTCAAA GCAAACACAG 541 ATTCCCCCTC CCCCTTAATA TTTAAGAATT AAAAGATGAT GAGAAATAAG GACAAAAGCC 601 AAGAGGAGGA CAGTTCGCTA CACAGCAATG CATCGAGTCA CTCAGCCTCT GAAGAAGCTT 661 CGGGTTCAGA CTCAGGCAGT CAGTCGGAAA GTGAGCAGGG AAGTGATCCA GGAAGTGGAC 721 ATGGCAGCGA GTCGAACAGC AGCTCTGAAT CTTCTGAGAG TCAGTCGGAA TCTGAGAGCG 781 AATCAGCAGG TTCCAAATCC CAGCCAGTCC TCCCAGAAGC CAAAGAGAAG CCAGCCTCTA 841 AGAAGGAACG GATAGCTGAT GTGAAGAAGA TGTGGGAAGA ATATCCTGAT GTTTATGGGG 901 TCAGGCGGTC AAACCGAAGC AGACAAGAAC CATCGCGATT TAATATTAAG GAAGAGGCAA 961 GTAGCGGGTC TGAGAGTGGG AGCCCAAAAA GAAGAGGCCA GAGGCAGCTG AAAAAACAAG 1021 AAAAATGGAA ACAGGAACCC TCAGAAGATG AACAGGAACA AGGCACCAGT GCAGAGAGTG - Trova i primers per fare una PCR di un frammento di circa 300bp di questa sequenza, trova i primers per una PCR nested. - Trova i primers per una PCR inversa e nested - Trova a che gene appartiene questa sequenza