Fotorecettori Come fanno i germinelli ad accorgersi della presenza, della quantità e della qualità di luce? Come cambia la pianta?

Un fattore ambientale essenziale nella vita delle piante: la LUCE Luce come SEGNALE  Segnali chimici (ormoni) Fotomorfogenesi Germinazione dei semi Inverdimento Fioritura Fototropismo …

Fotomorfogenesi Luce Buio Il processo di “riprogrammazione” del germinello dal punto di vista morfologico (ma anche biochimico…) scatenato dalla luce pp4e-fig-17-01-0.jpg

Scotomorfogenesi: morfogenesi al buio La luce regola lo sviluppo della pianta  1) rinverdimento, 2) allungamento (ipocotile- e radice+), 3) apertura cotiledoni Scotomorfogenesi: morfogenesi al buio

Plantule di mais (monocot) Anche nelle monocot ritroviamo i tratti fondamentali

Plantule di fagiolo L’effetto della dipende dalla lunghezza d’onda (non è solo una questione di quantità di fotoni)  c’è di mezzo più di un fotorecettore

Le λ NON sono equivalenti  spettro d’azione Germinazione dei semi di lattuga: l’induzione (non la germinazione) è reversibile La luce rossa stimola, quella rosso lontana inibisce. E’ cruciale quale tipo di luce colpisca i semi per ultima pp4e-fig-17-02-0.jpg Le λ NON sono equivalenti  spettro d’azione

Spettro d’azione per la stimolazione e l’inibizione della germinazione  Lo spettro d’azione a quale pigmento può corrispondere? Ipotizzato negli anni 40, il fitocromo viene rilevato nel 1959, purificato nel 1983 e clonato nel 1985. Uno o due pigmenti (responsabili) per i due effetti?

Spettro di assorbimento del fitocromo dall’avena (forma Pr e Pfr) I due spettri hanno una parziale sovrapposizione To cut a long story short... pp4e-fig-17-03-0.jpg

Pr Pfr Le due forme si interconvertono per effetto della luce Red light Pr Pfr Far-red light Equilibrio Fotostazionario Rosso 85% Pfr 15% Pr Rosso lontano 97% Pr 3% Pfr Il rapporto fra Pr e Pfr dipende dalla lunghezza d’onda della luce

In qualche modo i germinelli “vedono” diversi tipi di luce Risposta dei germinelli di Arabidopsis alla diverse qualità di luce In qualche modo i germinelli “vedono” diversi tipi di luce E’ facile ricercare mutanti che non rispondono  continuano ad allungare l’ipocotile (mutanti hy)

I mutanty hy di Arabidopsis hanno permesso di isolare diversi geni importanti nella fotomorfogenesi (tra cui alcuni per i fotorecettori

Funziona come sensore anche per la luce FR? I mutanti phyB mostrano una ridotta sensibilità alla luce rossa phyB agisce come sensore per la luce rossa Funziona come sensore anche per la luce FR?

Ricerca di mutanti insensibili alla luce FR No  phyB percepisce ancora lo stimolo FR E’ possibile trovar mutanti alterati nel recettore per il FR? Ricerca di mutanti insensibili alla luce FR F2 di semi mutagenizzati illuminati con luce FR Mutante che continua ad allungare

I mutanti phyA mostrano una ridotta sensibilità alla luce FR Il nuovo mutante è alterato nel gene per il fitocromo A I mutanti phyA mostrano una ridotta sensibilità alla luce FR

Il rapporto R/FR può cambiare nel tempo e nello spazio In sunlight most P gets converted to Pfr form. After a long night most gets converted to Pr. At dawn, most P gets converted to Pfr form again.

I germinelli phyA rimangono parzialmente eziolati negli ambienti ricchi in luce FR

I mutanti phyA cresciuti in luce normale non hanno fenotipo

I mutanti phyB al contrario hanno internodi più lunghi e fioriscono precocemente Questo fenotipo assomiglia a quello delle piante cresciute a basso R:FR

Esistono fitocromi diversi

La famiglia genica del fitocromo Classificazione 1) in base alla sequenza o 2) in base al comportamento dopo illuminazione Tipo I : fotolabile, alte concentrazioni in plantula eziolata Tipo II: fotostabile, presente in pianta alla luce Tipo I pp4e-fig-17-13-0.jpg Tipo II

PHYB,C, D e E sono stabili alla luce PHYA è labile alla luce

VLFR (Very Low Fluence Response) LFR (Low Fluence Response) Effetti diversi mediati dai fitocromi (fotorecettori) possono richiedere quantità diverse di luce: Fluenza: mmol fotoni/ m2 Irradianza: mmol fotoni/ m2 sec Irradianza = velocità di fluenza  QUANTITA’  INTENSITA’ VLFR (Very Low Fluence Response) LFR (Low Fluence Response) HIR (High Irradiance Response) (µmoli/m2)

Risposte mediate dal fitocromo Quantità di luce richiesta Fotoreversibilità Tempo di fuga Response mode Fluence requirement Photoreversibility Reciprocity valid VLFR 100 pmol/m2–100 nmol/m2 no yes LFR 1–1000  μmol/m2 HIR >1000   μmol/m2 Fluence requirements are based on Mancinelli, 1994 and references therein. LFR fluence requirements are for red light.

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VLFR Risposte con quantità di fotoni molto basse (da 0.0001 fino a 0.1 µmoli/m2): un decimo dei fotoni emessi da una lucciola durante un impulso Non fotoreversibili La luce produce quantità molto piccole di Pfr (<0.02%): qualsiasi luce non può esimersi dal produrre Pfr La luce far red converte solo il 97% del Pfr in Pr, per cui circa il 3% del fitocromo rimane come Pfr. Questo è molto di più dello 0.02% richiesto per indurre le risposte VLFR. E’ la forma Pfr quella attiva (che scatena la risposta biologica)

VLFR (Very Low Fluence Response) LFR (Low Fluence Response) HIR (High Irradiance Response) PhyA funziona in questo modalità (ma non solo)

Spettro d’azione HIR per l’inibizione della crescita dell’ipocotile (germinelli di lattuga al buio) Lo spettro d’azione non coincide con quello del fitocromo: sia il fitocromo che un altro recettore (criptocromo) contribuiscono ad inibire la crescita I due effetti si sovrappongono nello spettro di azione (ma è possibile distinguerli)

Ruoli antagonisti di PhyA e PhyB nel de-eziolamento Nelle risposte a bassa fluenza (LFR) è la % di Pfr che determina la risposta Nelle risposte ad alta irradianza (HIR) è importante il valore di Pr/Pfr Ruoli antagonisti di PhyA e PhyB nel de-eziolamento pp4e-fig-17-21-1.jpg

Pfr determina l’effetto (e non la scomparsa di Pr): Mutanti Arabidopsis senza la maggior parte dei fitocromi sono hy (hanno l’ipocotile lungo) in luce bianca o rossa phyABE phyA phyB wt phyBDE phyABDE Wild type (A), and mutants in phyA (B), phyB (C), phyBDE (D), phyABE (E) and phyABDE (F). Seedlings were grown in 8 h photoperiods of white light at 120 µmol photons m-2 sec-1. Scale bar represents 5 mm.

In luce bianca bassissima phyA non germina In luce rossa phyB ha l’ipocotile lungo L’effetto delle mutazioni varia con la specie: in pomodoro senza PhyA e i due PhyB, i frutti (ma solo quelli) mancano di clorofilla In luce rossa l’espressione di PhyC e PhyD (e anche PhyA) dipende da PhyB  Gli effetti sono dovuti alle regolazioni incrociate o alla mutazione?

La luce come segnale influenza molti processi del ciclo vitale

Il rapporto R/FR influenza non solo l’allungamento dell’ipocotile...

Molte piante quando esposte a luce con un basso rapporto di R/FR, hanno una risposta denominata “fuga dall’ombra” (shade avoidance)

In questo modo la pianta esplora lo spazio intorno alla ricerca di luce ottimale

NON è solo una questione di quantità di luce. Il sensore R/FR aiuta a sentire la presenza di competitori

(A) Seedlings of Datura ferox growing at increasing densities (32, 100 and 240 seedlings m-2) for three weeks. (B) As an even canopy develops with time, perception of the neighbors stimulates stem elongation, and increased leaf area results in a decrease in light intereception per plant. However, the elongation response precedes mutual shading. La risposta all’allungamento risponde al rapporto R/FR, NON alla quantità di luce

FUGA DALL’OMBRA luce rossa Le piante sciafile (che amano l’ombra) non hanno questa risposta (o l’hanno ridotta) FUGA DALL’OMBRA pp4e-fig-17-20-0.jpg luce rossa

Le vecchie varietà di mais erano piantate a circa 30.000 piante/ettaro Le varietà moderne sono piantate a una densità di 70-80.000 piante /ettaro

Come è fatto il fitocromo?

Cromoforo + Apoproteina = Oloproteina Fitocromobilina + Catena polipeptidica = Fitocromo

Prodotti di degradazione dell’eme nei sistemi animali

Structura delle forme di Pr e Pfr del cromoforo (fitocromobilina) Nell’isomero cis l’azoto e il metile sono in cis L’assorbimento della luce porta ad una isomerizzazione del cromoforo L’isomerizzazione causa a sua volta un cambio nella conformazione della proteina In realtà si dovrebbe andare a guardare altri atomi invece di H e N, ma il messaggio non cambia Nell’isomero trans vale il contrario

Assemblaggio del fitocromo (Pr) Sintesi del cromoforo Assemblaggio del fitocromo (Pr) Conversione in Pfr  Effetto biologico Isomerizzazione cis-trans e cambio conformazionale

C’è anche un effetto sui flussi di ioni (molto veloce) Effetti di Pfr L’esposizione del NLS determina l’importo nel nucleo con un effetto sull’espressione genica C’è anche un effetto sui flussi di ioni (molto veloce) pp4e-fig-17-08-2.jpg

Il fitocromo è una proteina kinasi autofosforilante pp4e-fig-17-10-2.jpg

L’attività del fitocromo è modulata dallo stato di fosforilazione La fosforilazione regolatoria avviene in siti diversi dall’autofosforilazione pp4e-fig-17-14-0.jpg

Proteine COP regolano il turnover di regolatori dello sviluppo COP1 interagisce con il fitocromo (dopo la traslocazione al nucleo) Giorno pp4e-fig-17-15-0.jpg Notte

Meccanismo d’azione e secondi messaggeri Il mutante aurea di pomodoro non sente lo stimolo fotomorfogrnrtico. Fornendo fitocromo e luce rossa (o cGMP e Ca2+) si induce il rinverdimento

cGMP, Ca++, calmodulina e le proteine G sono secondi messaggeri

Il network a valle è complesso e lungi dall’essere chiarito

Si conoscono alcuni early targets come un fattore di trascrizione Myb che a sua volta regola i geni fotosintetici come LhcB (Light Harvesting Complex B)

L’induzione de messaggero di Myb è molto precoce e precede quella del messaggero di LhcB

Mutante cop1D costitutive photomorphogenesis1 WT al buio cop1 al buio COP / DET / FUS Fenotipo fusca

Spettro d’azione ad alta intensità per l’inibizione della crescita dell’ipocotile (germinelli di lattuga al buio) Nella zona blu dello spettro l’inibizione della crescita da chi è mediata?

 Non può essere il fitocromo, deve esistere un recettore per il blu Mutanti di Arabidopsis phyA phyB sono ancora inibiti dalla luce blu per quanto riguarda l’allungamento dell’ipocotile  Non può essere il fitocromo, deve esistere un recettore per il blu Effetto dovuto a PhyA Effetto dovuto al Criptocromo

Recettori per il blu: CRIPTOCROMI Cry 1, 2 in Arabidopsis Fenotipo del mutante hy4 (= cry1) Alla luce CRY1 è stabile, mentre CRY2 viene degradato.

La loro attività è regolata da fosforilazione La loro attività è regolata da fosforilazione. Interagiscono con PHYA che le fosforila Sullivan and Deng, Developmental Biology 260 (2003) 289–297

Gli effetti della luce blu sono veloci Criptocromo Spettro d’azione Anche per il criptocromo esistono eventi precoci sulla membrana plasmatica (attivazione di canali anionici) e regolazione della trascrizione. Traslocano al nucleo in seguito ad illuminazione e interagiscono con COP1.

Physiological characteristics of cryptochrome and phototropin mutants. Fototropismo: non è mediato dal criptocromo perché i mutanti cry1 e cry1cry2 hanno una risposta fototropica normale al blu. Physiological characteristics of cryptochrome and phototropin mutants. A, blue light-dependent inhibition of hypocotyl elongation in wild-type (WT), cry1 (hy4) mutant,cry1/cry2 double mutant, and nph1mutant Arabidopsis seedlings. Seedlings were grown for 3 days in continuous blue light from above (20 μmol m−2s−1). B, hypocotyl phototropism in 3-day-old wild-type and mutant seedlings exposed to 6 h of unilateral blue light (1 μmol m−2 s−1). Nph1 (non phototropic1) rinominato phot1 (phototropin1) Christie J M , Briggs W R J. Biol. Chem. 2001;276:11457-11460 ©2001 by American Society for Biochemistry and Molecular Biology

Light sensing by the LOV domains of phototropin. Le fototropine hanno come cromoforo FMN. In seguito all’assorbimento della luce si forma un legame covalente Light sensing by the LOV domains of phototropin. A, purified LOV2 from oat phototropin viewed under UV light. B, schematic representation illustrating the proposed light-induced formation of a C(4a)-thiol adduct between the FMN chromophore and a conserved cysteine residue within the LOV domain. Christie J M , Briggs W R J. Biol. Chem. 2001;276:11457-11460 ©2001 by American Society for Biochemistry and Molecular Biology

Risposta fototropica del wt (WS e Ler) e del mutante quadruplo The +cry1, +cry1T, +cry2, and +cry2T mutants show hypocotyl curvatures that are irrelevant to the phototropic vector. Shown are phototropic responses of the wild types (WS and Ler), the quadruple mutant (quad), and the +phot1, +phot1T, +phot2, +phot2T, +cry1, +cry1T, +cry2, and +cry2T mutants. Each plant was exposed to blue light at a fluence rate of 100 μmol·m–2·sec–1 for 12 h. (For further details, see Supporting Text.) The light source was to the left in the pictures. The arrowhead indicates a knot in one hypocotyl. Risposta fototropica del wt (WS e Ler) e del mutante quadruplo Ohgishi M et al. PNAS 2004;101:2223-2228 Phot2 media le risposta afluenza più alta ©2004 by National Academy of Sciences

Stomatal opening under blue light Cry1 e Cry2 regolano l’apertura stomatica alla luce blu Stomatal opening under blue light Stomatal opening under blue light. (A) Schematic diagrams displaying constructs expressing CRY1 and Myc-tagged CRY2. (B) Six-day-old Arabidopsis seedlings of the WT, cry1, cry1 cry2, CRY1-ovx, and CRY2-ovx plants grown under 5 μmol·m-2·s-1 blue light. (Scale bar, 1 mm.) (C) Immunoblot showing expression of CRY1 by using α-CCT1 antibody. Line 4 [CRY1-ovx (4), lane 3] is shown in B and used for all of the phenotypic analysis throughout this study. *, a band nonspecifically recognized by the antibody. (D) Western blot showing expression of Myc-CRY2 by using α-Myc antibody. Line 9 [CRY2-ovx (9), lane 3] is shown in B and used to generate the data shown in E and F. (E) Confocal images of stomata of the WT, cry1, cry2, cry1 cry2, CRY1-ovx, and CRY2-ovx plants. Epidermal strips were illuminated with 5 μmol·m-2·s-1 blue light under background 50 μmol·m-2·s-1 red light for 3 h. (Scale bars in this and other confocal images represent 10 μm.) (F) Stomatal apertures under different light conditions in the WT, cry1, cry2, cry1 cry2, CRY1-ovx, and CRY2-ovx plants. Stomatal opening was induced by 50 μmol·m-2·s-1 red light and 20 μmol·m-2·s-1 blue light plus 50 μmol·m-2·s-1 red light. Stomata of the WT plants open significantly wider than those of the cry1 single and cry1 cry2 double mutant at *, P ≤ 0.05 and **, P ≤ 0.01 under 20 μmol·m-2·s-1 blue light plus 50 μmol·m-2·s-1 red light (Student's t test), respectively. (G) Fluence rate dependency of stomatal opening in response to blue light. The measurements represent stomatal apertures obtained at different fluence rates of blue light under background 50 μmol·m-2·s-1 red light. Mao J et al. PNAS 2005;102:12270-12275 ©2005 by National Academy of Sciences

Assorbimento della luce  cascata di eventi  risposte fisiologiche Spesso una risposta fisiologica è influenzata da più fotorecettori e mediata dalla modulazione dell’attività/azione di più ormoni (es. il fototropismo implica la redistribuzione laterale di auxina)

Il fitocromo e i recettori della luce blu esplorano zone diverse dello spettro

Integratori dei segnali che arrivano dai vari recettori