Regolatori della divisione cellulare Citochinine Regolatori della divisione cellulare

Molte cellule vegetali sono totipotenti - Dopo coltura in vitro, molte cellule possono dare luogo a piante intere (es. cellule di guardia) In seguito a ferita le cellule possono ricominciare a dividersi Tomato stem Infection with Agrobacterium tumefaciens at the wound site causes tumor-forming disease crown-gall (unorganized mass of tumor-like tissue) → natural evidence of the mitotic potential of mature plant cells Haberlandt 1913: vascular tissue contains a water-soluble substance that will stimulate division of wounded potato tuber tissue → discovery of cytokinins in 1950s

Scoperta, identificazione e proprietà Philip White: nutrient medium, supplemented with auxin and 10-20% coconut milk supports cell division of mature, differentiated cells from a variety of tissues and species, leading to formation of callus tissue. ↓ Coconut milk contains substance/s that stimulate/s mature cells to enter and remain in cell division cycle. Coconut milk was shown to contain the cytokinin zeatin. The very first cytokinin discovered was the synthetic analog kinetin. Kinetin A breakdown product of DNA

La Zeatina è la citochinina naturale più abbondante Extracts of immature endosperm of corn (Zea mays) contain a substance with the same biological effect as kinetin. This substance stimulates mature plant cells to divide when added to culture medium along with auxin. Letham (1973) isolated that substance, called zeatin. Kinetin

Alcuni batteri patogeni, insetti e nematodi producono citochinine libere L’infezione di tessuti vegetali da parte di questi organismi induce il tessuto a dividersi e in alcuni casi a formare strutture speciali (galle di insetti che sono usate come “feeding sites” e protezione) Scopa della mstrega sull’abete causata da Corynebacterium fascians; Le gemme laterali (normalmente dormienti) sono stimolate a crescere dalla citochinina prodotta dal batterio

T-DNA of Agrobacterium tumefaciens encodes an enzyme of cytokinin biosynthesis. PNAS (1984) 81:5994-5998 Tumore su un fusto di Paullonia Tumore su una foglia di oleandro Tumori vari

Insetti (es. afidi) Nipple gall http://www.epress.com/w3jbio/vol2/mcdermott/mcdermott.html

Biosintesi, trasporto e metabolismo Root apical meristem = major site of free cytokinins in whole plant. Transport of cytokinins from roots to shoot via xylem. Cytokinins are rapidly metabolized by cytokinin oxidase, thereby inactivating cytokinins. (isopentenyladenine)

Importanza delle citochinine nello sviluppo

Il mutante risulta insensibile alle citochinine Mutante di Arabidopsis che manca di tutti i recettori per lo citochinine The shoot and root growth of triple mutants was very slow, and leaf numbers were decreased and the plant occasionally produced an inflorescence stem with abnormal and nonfunctional flowers, but did not produce seeds. Le radici del mutante triplo crescono per pochi giorni e poi si fermano Il mutante risulta insensibile alle citochinine

Phenotype of the triple mutant grown with or without t-zeatin. Thirteen-day-old WT seedlings (Col) Higuchi M et al. (2004) PNAS 101:8821-8826 100 ng/ml 1,000 ng/ml t-zeatin Phenotype of the triple mutant grown with or without t-zeatin. (A–C) Thirteen-day-old WT seedlings from the ecotype Col. (D–F) Thirteen-day-old cre1–12 ahk3–3 ahk2–2 (Col) triple mutants. Plants were grown on plates with 0ng/ml (A and D), 100 ng/ml (B and E), 1,000 ng/ml t-zeatin (C and F). (Bars = 5 mm.)‏ Thirteen-day-old triple mutant cre1–12 ahk3–3 ahk2–2

Ruolo biologico delle citochinine Le citochinine regulano la divisione cellulare in vivo Tabacco che sovraesprime il gene catabolico (citochinina ossidasi) → riduzione nei livelli di citochinina endogenous → inibizione della crescita del fusto dovuta a una ridotta velocità di proliferazione nel SAM AtCKX1-OX AtCKX1 = Arabidopsis cytokinin oxidase WT

Citochinina richiesta per la normale crescita del SAM SAM del tabacco wt SAM del tabacco transgenico sovraepressione di AtCKX1 → carenza di citochinina → SAM di dimensioni ridotte

Citochinina: riduce la crescita delle radici Citochinina deprime le dimensioni e la divisione cellulare a livello delle radici. Citochinine hanno ruuoli opposti nel regolare la proliferazione cellulare nel RAM (Root Apical Meristem) e nel SAM. WT tobacco AtCKX1-OX Cytokinin-deficient

Il rapporto auxina:citochinina regola la morfogenesi dei tessuti in coltura Shoots Callus No growth Plant tissue Roots Nutrient agar Auxin Kinetin Ratio: 15 150 0.003 High auxin:cytokinin ratio: root Low auxin/cytokinin ratio: shoot Intermediate auxin/cytokinin ratio: callus

Citochinina rallenta la senescenza fogliare invecchiamento programmato porta alla morte del tessuto La senescenza fogliare è ritardata in tabacco transgenico contenente alti livelli di citochinine.

Ormoni e fotomorfogenesi Gli ormoni vegetali hanno un effetto sulla crescita e sulla morfogenesi Questo effetto è modulato dalla presenza della luce I recettori (PHY, CRY, PHOT) interagiscono con le vie degli ormoni e ne modulano l’attività esempi: citochinine, brassinosteroidi, (già menzionati etilene, auxina, GA) ...

Ormoni e fotomorfogenesi: citochinine Citochinine producono una fenocopia del mutante det:  aumentano la de-eziolatura di piante cresciute al buio Buio Buio + citochinine I plastidi si sviluppano parzialmente

Brassinosteroidi (un ormone della crescita)

Brassinosteroids Brassinolide I and II indicate regions of variations.

Scoperta dei Brassinosteroidi Scoperti come agenti stimolanti la crescita e presenti nel polline della colza Mitchell 1970  chiama queste sostanze Brassine Occur in Brassicaceae (mustards, cauliflowers, cabbages, turnips, Arabidopsis)

Stimolano la crescita anche di internodi Brassine inducono l’allungamento di steli in fagiolo: Mandava 1988 Bean second internode bioassay Non è stato riconosciuto come un ormone fino alla metà degli anni 90 Untreated control

Fenotipi dei mutanti di Arabidopsis bri1 – brassinosteroid insensitive 1 cpd – constitutive photomorphogenic and dwarfism det2 – de-etiolated2 BRI – brassinosteroid receptor WT det2 det2 cpd het bri1 het cpd hom bri1 hom CPD e DET2 sono enzimi della via biosintetica Il mutante det2 è nano det2 wt WT det2 (adult) WT (adult) det2

Brassinolide e gli intermedi della via biosintetica ristorano la normale crescita del mutante cpd — no sterioid CL, campesterol CT, cathasterone TE, teasterone DT, 3-dehydroteasterone TY, typhasterol CS, castasterone BL, brassinolide

Via biosintetica semplificata del BL Single reactions Multiple reactions

Isolamento di un recettore dei brassinosteroidi Li and Chory (1997) A putative leucine rich repeat receptor kinase involved in brassinosteriod signal transduction. Cell 5: 929 Light He et al. 2000 Perception of brassinosteroids by the extracellular domain of the receptor kinase BRI1, Science: 288, 2360 2000 Dark 2 month light BIN locus renamed BRI In animals, there are RTKs (receptor tyrosine kinases) to perceive steroids - In plants, there are always serine- threonine kinases and they are called RLKs (receptor-like kinases). - Steroids perceived at membrane

BRI1 is an LRR serine/threonine kinase TM – transmembrane domain

Some experiments that show BRI1 is the receptor

Plant receptor-like kinases LRR = Leucine-rich repeat From Shiu and Bleecker 2001 PNAS 98: 10763

The Domain structure of the BRI1 receptor

A Model of BR Signaling (1) (2) (3) (7) (4) (6) (5) (8)

Brassinosteroids-mediated physiological responses Inibiscono: crescita delle radici (ma in alcuni casi la promuovono) abscissione fogliare Stimolano: Allungamento di cellule e steli e la divisione promuovono la crescita Srotolamento e curvature nelle erbacee produzione di etilene germinazione dei semi e fotomorfogenesi differenziamento dello xilema Crescita del tubetto pollinico

http://plantphys.info/plant_physiology/cytokinin.shtml