TRASCRIZIONE del DNA

DNA ---> RNA ---> Proteina TRASCRIZIONE TRADUZIONE

La sintesi di RNA richiede uno stampo di DNA e procede da 5’ --> 3’ E’ mediata dalla RNA polimerasi

La sintesi di RNA utilizza come stampo la catena inferiore 5’ – ATTGGGCGCGATGGTTTATAGATCTACCCATAGTCTGC – 3’ 3’ – TAACCCGCGCTACCAAATATCTAGATGGGTATCAGACG – 5’ La sintesi di RNA utilizza come stampo la catena inferiore RNA risultante simile alla catena superiore 5’ – AUUGGGCGCGAUGGUUUAUAGAUCUACCCAUAGUCUGC – 3’

5’ Regione regolatoria Regione trascritta 3’

CONTROLLO SINTESI PROTEICA PROCARIOTI non possiedono nucleo il DNA genomico è sparso nel citoplasma la trascrizione è accoppiata alla traduzione EUCARIOTI il DNA genomico è organizzato in cromosomi nel nucleo presenza di istoni associati al DNA e formazione di cromatina la trascrizione avviene nel nucleo. La traduzione nel citoplasma dopo che l'RNA è maturato a messaggero (perdita degli introni, poliadenilazione, ecc.)

CONTROLLO GENICO Nei PROCARIOTI serve per: Negli EUCARIOTI serve per: Adattare il batterio ai cambiamenti nutrizionali divisione cellulare Negli EUCARIOTI serve per: Regolare un programma genetico alla base dello sviluppo embrionale e del differenziamento cellulare e tissutale

CONTROLLO GENICO NEI PROCARIOTI nei batteri il controllo genico può avvenire: - a livello dell'inizio della trascrizione - a livello della terminazione della trascrizione - a livello del ricambio dell'RNA (stabilità dell'mRNA)

INIZIO DELLA TRASCRIZIONE NEI PROCARIOTI RNA polimerasi possiede 2 subunità uguali α 2 subunità diverse β e β' (legano il DNA aspecificamente) 1 subunità ω

PROTEINE ACCESSORIE della RNA polimerasi FATTORE σ aiuta l'RNA polimerasi a riconoscere sequenze specifiche del DNA a livello del promotore. Si conoscono diversi tipi di fattori σ: variano per i diversi promotori.

Il complesso RNA polimerasi con il Fattore σ si chiama OLOENZIMA L’oloenzima legato al DNA separa la struttura a doppia elica e comincia a formare RNA sul templato di DNA Dopo l’inizio della trascrizione il fattore σ si stacca

INDUZIONE O REPRESSIONE DELLA TRASCRIZIONE GENICA BATTERICA SOSTANZE NUTRITIVE - induzione enzimatica: solo quando una determinata sostanza nutritiva e’ presente (oppure e’ assente) INDUZIONE / REPRESSIONE velocita’ di sintesi dell’enzima Quantita’ di enzima teorico sperimentale tempo

OPERONI Vengono chiamati OPERONI dei geni in successione controllati da un unico promotore. L'OPERONE da origine ad un singolo RNA messaggero che viene detto POLICISTRONICO, perchè codifica più di una proteina (CISTRONE è l'unità genetica più piccola che codifica un solo peptide). I geni di un operone spesso codificano gli enzimi diversi di una sola via metabolica. Essi vengono così controllati in modo coordinato.

Ogni segmento codificante di un mRNA policistronico è tradotto in modo indipendente perché ogni porzione possiede il suo - SITO DI LEGAME PER IL RIBOSOMA, - il proprio CODONE DI INIZIO e il proprio CODONE DI TERMINAZIONE.

-35 -10 +1 Proteine X Y Z

OPERONE LAC

ASSENZA DI LATTOSIO - PRESENZA GLUCOSIO

PRESENZA DI LATTOSIO - PRESENZA DI GLUCOSIO

PRESENZA DI LATTOSIO - ASSENZA DI GLUCOSIO
 L’assenza di GLUCOSIO porta ad un AUMENTO dei LIVELLI di cAMP cAMP lega --> proteina attivatrice del catabolismo [CAP] --> azione attivatoria sul promotore

CONTROLLO DELLA TRASCRIZIONE NEI PROCARIOTI PROTEINE BATTERICHE STRUTTURALI (GENI STRUTTURALI) Sono in genere trascritte in modo COSTITUTIVO, a velocità più o meno costante, ed entrano a far parte di membrane, ribosomi, ecc. PROTEINE BATTERICHE REGOLATRICI (GENI REGOLATORI) - meno numerose - permettono di percepire le variazioni ambientali; - legano il DNA alterando la velocità di trascrizione dei geni strutturali in senso positivo o negativo. le proteine batteriche regolatrici si dividono in: REPRESSORI e ATTIVATORI

REPRESSORI DELLA TRASCRIZIONE GENICA °°°°°°°°°°°°°°°°°°°°° sono le proteine regolatrici ad azione negativa; impediscono il legame con dell'RNA polimerasi (oloenzima) al DNA, interagendo con determinate sequenze a livello del sito OPERATORE, spesso localizzato vicino al PROMOTORE. °°°°°°°°°°°°°°°°°°°°° i REPRESSORI possono combinarsi con piccole molecole dette EFFETTORI che influenzano l'affinità del legame del repressore con il DNA.

INDUTTORI o COREPRESSORI Gli EFFETTORI possono essere INDUTTORI o COREPRESSORI gli INDUTTORI si combinano con il repressore e ne diminuiscono l'affinità di legame con il DNA. - i COREPRESSORI hanno il ruolo opposto, in tal caso il repressore funziona solo in presenza del suo effettore corepressore. R(attivo) + I --> R-I(inattivo) NO TRASCRIZIONE R(inattivo) + CR --> R-CR (attivo) NO TRASCRIZIONE R = repressore I = induttore CR = corepressore

ATTIVATORI DELLA TRASCRIZIONE GENICA °°°°°°°°°°°°°°°°°°°°° sono le proteine regolatrici ad azione positiva; si legano al DNA interagendo con determinate sequenze a livello del sito PROMOTORE o vicino ad esso; aumentano la frequenza con cui l'RNA polimerasi (oloenzima) si lega al promotore. °°°°°°°°°°°°°°°°°°°°° anche gli ATTIVATORI possono utilizzare un EFFETTORE.

CONTROLLO COMPOSTO DELLA TRASCRIZIONE GENICA una diminuzione del GLUCOSIO porta alla produzione di: EFFETTORE --> AMP ciclico che lega e attiva una ATTIVATORE --> PROTEINA ATTIVATRICE del CATABOLISMO (CAP), che serve per molti geni diversi. L' OPERONE lac è sotto il controllo: positivo del complesso CAP-cAMP negativo della proteina repressore per il lattosio.

CONTROLLO DELLA TERMINAZIONE DELLA TRASCRIZIONE E' meno determinante di quello effettuato sull'inizio della trascrizione. Avviene alla fine di un gene su appositi SITI DI TERMINAZIONE ricchi di G e C. Alcune proteine funzionano da fattori di terminazione: es il FATTORE RHO (proteina specifica)

TERMINAZIONE DIPENDENTE DAL FATTORE RHO la proteina (fattore RHO) forma un esamero su cui si avvolge l'RNA in formazione, provocandone il discacco dal DNA templato. - TERMINAZIONE INDIPENDENTE DAL FATTORE RHO:

EUCARIOTI

NUCLEOLO Sede della trascrizione degli RNA ribosomiali ed assemblaggio dei ribosomi

90% cromatina decondensata dispersa nel nucleo EUCROMATINA 90% cromatina decondensata dispersa nel nucleo --> consente la trascrizione dei geni ETEROCROMATINA 10% cromatina nello stato compattato --> non consente la trascrizione dei geni Alla MITOSI eucromatina  eterocromatina

ISTONI Gli istoni, proteine cariche positivamente (aa basici), interagiscono con il DNA carico negativamente per i gruppi fosfato. Cinque tipi di istoni: 4 in doppio formano un ottamero intorno al quale il DNA si avvolge in modo sinistrorso chiamato nucleosoma, bloccato dall’Istone H1

INIZIO TRASCRIZIONE NEGLI EUCARIOTI TRE tipi di RNA polimerasi (nei batteri solo 1) RNA polimerasi I sintetizza RNA ribosomiale RNA polimerasi II sintetizza gli mRNA RNA polimerasi III sintetizza gli piccoli RNA (tRNA, RNA 5S)

RNA POLIMERASI E FATTORI DI TRASCRIZIONE I FATTORI DI TRASCRIZIONE sono proteine che facilitano l'interazione tra la RNA polimerasi ed il DNA. Si dividono in: -Fattori richiesti per l'inizio della trascrizione; -Fattori che aiutano il processo di allungamento dell'RNA da parte dell'RNA polimerasi; -Fattori che partecipano alla formazione di un complesso attivo di preinizio, che non sono più richiesti nelle fasi avanzate della trascrizione.

primi due sono FATTORI GENERALI necessari per la trascrizione di tutti i geni Gli ultimi sono FATTORI SPECIFICI, servono solo per particolari geni e corrispondono alle proteine regolatrici trovate nei procarioti.

RNA Polimerasi I Due fattori di trascrizione (UBF e SL1) si legano al promotore dell’rDNA. Reclutano la RNA polimerasi I formando il complesso di inizio si legano al DNA che codifica i vari RNA ribosomiali ed aiutano la RNA polimerasi I SL1 e’ formata da diverse proteine associate al TBP (TATAbox binding protein)

RNA Polimerasi III Sintetizza gli RNA 5S (nucleoli e citoplasma) Sintetizza gli RNA transfer (tRNA) I promotori per questi due geni sono a valle del sito di inizio della trascrizione Sintetizza l’snRNA U6 Il suo promotore è a monte del sito di inizio della trascrizione

RNA Polimerasi III RNA 5S (nucleoli e citoplasma) Richiede TFIIIA legato a TFIIIB+TFIIIC RNApolIII RNA transfer (tRNA) NON richiede TFIIIA ma solo snRNA U6 Richiede la TBP(TFIIB)+SNAP

formazione degli trascritti primari di RNA RNA Polimerasi II formazione degli trascritti primari di RNA La maggior parte degli mRNA (che derivano dalla maturazione del trascritto primario) è MONOCISTRONICA, quindi sono tutti controllati da un loro promotore specifico. L'RNA polimerasi II inizia la sintesi a livello del sito CAP. Il sito CAP e’ preceduto dal TATA box TATA box sequenza altamente conservata, collocata a circa 25-35 nucleotidi a monte del sito CAP di inizio della trascrizione.

Eucarioti Regioni upstream Regioni downstream <---------- trascrizione ----------> Sito CAP introni Promoter esoni Eucarioti TATA box -200 -160 -120 -80 -40 -1

CONTROLLO DELLA TRASCRIZIONE NEGLI EUCARIOTI La RNA polimerasi II richiede molti FATTORI DI TRASCRIZIONE diversi da quelli della I e della III. Il più importante è il TFIID, proteina di circa 100 Kda che lega il TATA box Il TFIID e’ composto dal TBP (TATAbox binding protein)+ TAF (TBP associated proteins)

CONTROLLO DELLA TRASCRIZIONE NEGLI EUCARIOTI FATTORI BASALI DELLA TRASCRIZIONE La RNA polimerasi II richiede molti FATTORI DI TRASCRIZIONE diversi da quelli della I e della III. Il più importante è il TFIID, proteina di circa 100 Kda che lega il TATA box Il TFIID e’ composto dal TBP (TATAbox binding protein)+ TAF (TBP associated proteins) TFIIB e TFIIE aiutano il TFIID a legarsi al DNA, ma non possono legarsi da soli. TFIIB si lega alla RNA polimerasi II anche da solo. Esistono poi molti altri fattori di trascrizione, tra cui TFIIF, TFIIH………..

Eucarioti Promoter introni Sito CAP <---------- trascrizione ----------> esoni Regioni upstream Regioni downstream Eucarioti TATA box -200 -160 -120 -80 -40 -1

Eucarioti Promoter introni Sito CAP <---------- trascrizione ----------> esoni Regioni upstream Regioni downstream Eucarioti GC box - CAAT box (altri) TATA box -200 -160 -120 -80 -40 -1

SEQUENZE PROSSIMALI DEL PROMOTORE Oltre al TATA box sono state identificate altre sequenze conservate a livello del promotore: GGGCG: lega una proteina chiamata SP1 (stimulatory protein 1) che attiva la trascrizione. CCAAT: lega una grossa famiglia di proteine regolatrici

Eucarioti Regioni upstream Regioni downstream <---------- trascrizione ----------> Sito CAP introni Enhancers Elementi responsivi Promoter esoni Eucarioti GC box - CAAT box (altri) TATA box -200 -160 -120 -80 -40 -1

INTENSIFICATORI (Enhancers) Sequenze di DNA che legano proteine specifiche; se attivate possono aumentare la trascrizione genica basale anche di 20-50 volte. Sono in genere collocate a monte del TATA box, a distanze variabili tra 100 e 2.000 bp. A volte però, possono essere collocate anche a notevole distanza dal TATA box (40.000 bp) o nel primo introne, o nella regione 3' non tradotta.

Eucarioti Regioni upstream Regioni downstream <---------- trascrizione ----------> Sito CAP introni Elementi responsivi Enhancers Promoter esoni Eucarioti GC box - CAAT box (altri) TATA box -200 -160 -120 -80 -40 -1

5’ esone 1 2 3 4 5 6 7 8 3’ COOH NH2 DNA ORMONE HINGE N - terminale

Mechanism of activation of the androgen receptor hsp hsp RNA pol II TFIID E hystone acetyl transferase co-activators F B H hsp T T DHT 5a-RII ARE TATA responsive GENE mRNA new proteins

Zn mRNA protein polyGln P PP P P A S P S P P = phosphorylation A = acetylation S = sumoylation Transactivation domain/(AF-1/AF-5) \ ID NLS AF-2 DNA binding domain H12 Hormone binding 5'-UTR Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Exons 5/6/7/8 3'-UTR (CAG)n Upstream ORF AUG1-UGA AUG2 mRNA protein polyA

Zn H12 Transactivation domain/(AF-1/AF-5) \ ID NLS AF-2 polyGln P PP P P A S P S P Transactivation domain/(AF-1/AF-5) \ ID NLS AF-2 DNA binding domain H12 Hormone binding

(D-box) x 2

Claessens et al. Nuclear Receptor Signaling, 2008

Istone-acetil-trasferasi