S e J: proprietà sistemiche Se il RLS non va bene con cosa possiamo sostituirlo? S e J: proprietà sistemiche * Le questioni del controllo non possono essere trattate guardando solamente allo stadio isolato. * Ciascuna variabile (metabolita o flusso) non è determinata da un singolo stadio ma dipende in generale da tutti, magari in maniera diversa. Come possiamo formalizzare questo in maniera quantitativa? * Se vogliamo risposte quantitative dobbiamo porre domande quantitative

Le vie metaboliche Serie di intermedi metabolici (A,B,C…) “collegati” tra di loro da enzimi (E1, E2 …). Nel mare magnum delle possibili reazioni a cui i metaboliti possono dare luogo, la specificità e peculiarità della catalisi enzimatica permettono, rispettivamente, una selezione molto ristretta e condizioni molto blande di reazione. E1 E2 E3 E4 Le quantità di enzima e le relative leggi cinetiche determinano i flussi

Come descrivo in termini quantitativi una via metabolica? Definire la via metabolica e i suoi confini Cercare leggi cinetiche adeguate per tutti gli enzimi/processi Scrivere il sistema di equazioni che, una volta risolte, portino a esprimere le variabili (ad es. la concentrazione dei metaboliti o il flusso) in funzione dei parametri del sistema e del tempo J = f(A, B, P1, P2, X1,X2, t…)

Una via metabolica: qualche concetto in più X0  S1  S2  S3 …..  X1 E1 E2 E3 E4 … En n enzimi (ciascuno con la sua legge cinetica) e.g. vE2= f (A1, A2, A5, VmaxE2 …) n-1 substrati 2 metaboliti esterni (X0 and X1) X sta per eXternal, S sta per Substrato (anche se il substrato di una reazione è il prodotto della precedente) Attenzione: vie ramificate, cicliche con cofattori…

Come impostare (e risolvere) il problema? = volume Equazione per S2: Ricordate che il volume delle cellule può variare! (per crescita, con o senza divisione cellulare) G: tasso di crescita (dV/dt)/V S2 è il substrato dell’enzima E2, v2 la velocità dell’enzima E2, V è il volume e G è il tasso di crescita, (dV/dt)/V

Per S2 vale la relazione: (dS2/dt) = v2 - v3 - GS2 Se fate lo stesso per tutti i metaboliti (scrivere un’equazione) arrivate ad un insieme di equazioni non lineari 0 = v2 - v3 0 = v3 – v4 0 = v4 – v5 …..e così via (in presenza di diramazioni la cosa si complica) (dS2/dt) = v2 - v3 - GS2 (dS3/dt) = v3 – v4 - GS3 (dS4/dt) = v4 - v5 - GS4 …..e così via Allo steady state = 0 (flusso costante) e con G=0 (la cellula/ tessuto non cresce di volume), il sistema si semplifica

Provando a risolvere il sistema…  E’ possibile scrivere il sistema, ma non è facile risolverlo! Perché v = f (E2, S2, S3, P1, P2, X0, X1…) cioè funzione della concentrazione di substrati e prodotti, della quantità di enzima, della temperatura, dei metaboliti esterni (distinzione tra parametri e variabili) C’è bisogno di strumenti adeguati per affrontare il problema; inizieremo con un breve ripasso delle cinetiche enzimatiche.

Quanto un parametro influenza un flusso? v1 v2 v3 v4 … vn X0  S1  S2  S3 …..  X1 E1 E2 E3 E4 … En Come varia il flusso se vario la quantità di enzima? Poco o tanto? Quanto varia il flusso se vario la quantità di enzima? Per spiegare il controllo del flusso abbiamo bisogno di introdurre il concetto di elasticità, una proprietà locale

Elasticità o ordine di reazione Breve introduzione all’elasticità Occorre meditare sui concetti e rileggere la letteratura

La differenza può essere grande (Δ) o piccola (δ) Elasticità (ε) L’elasticità è una proprietà locale e ci dice come varia la velocità di un enzima al variare della concentrazione di un metabolita con cui l’enzima interagisce (S, P, I ,…) Viene anche definita come ordine di reazione E’ la pendenza sul grafico v funzione di S (e ci si aspetta che sia funzione di S) quando la scala è logaritmica. ΔS  Δv δS  δv La differenza può essere grande (Δ) o piccola (δ)

Il coefficiente angolare si ottiene passando al limite... Elasticità: coefficiente angolare nello spazio logaritmico Siccome la variabile è, in questo caso, il substrato (S), allora si parla di elasticità al substrato.

Elasticità al substrato per una MM irrev. ε Provate a ricavare l’espressione dell’elasticità per derivazione matematica S/KM Provate a esercitarvi con vExplorer

Elasticità e derivata prima v, v' o ε Elasticità Derivata prima S/KM e a P?

Potete arrivare lo stesso risultato derivando la formula di MM? L’elasticità varia tra 1 e 0 (corrispondenti a S=0 e infinito) Potete arrivare lo stesso risultato derivando la formula di MM? Ricavate l’elasticità a S e quella a P per via matematica. Prova prima a risolverlo, altrimenti vai a vedere

Elasticità al substrato per una MM rev. Come si ricava? ? Cosa succede? L’elasticità varia tra + infinito e – infinito; (attenti a v= 0)

Elasticità e derivata prima MMrev

Prova a ricavarlo! (soluzione…) L’elasticità al substrato di un enzima reversibile possiede due componenti: * Una di natura termodinamica che dipende da quanto la reazione è spostata dall’equilibrio * Una di natura cinetica che dipende da quanto l’enzima è saturato rispetto al substrato (prodotto) L’elasticità distingue tra i contributi termodinamici e cinetici in maniera additiva (invece che moltiplicativa) come accadeva per l’espressione della velocità

Un enzima può possedere diversi tipi di elasticità Elasticità al substrato Elasticità al prodotto Elasticità alla quantità di enzima, attivatori, inibitori…

Il termine cinetico è la chiave della regolazione Quanto più lontana è una reazione dall’equilibrio tanto maggiore è il potenziale per la regolazione Quando ρ  0 (siamo lontani dall’equilibrio) questo termine diventa significativo Quando ρ  1 (siamo vicini all’equilibrio) questo termine assume valori molto grandi

Elasticità al substrato per un enzima cooperativo Usando l’equazione di Hill con n=2, l’elasticità varia 0 e 2

L’elasticità è indipendente da VM Derivazione della formula per l’elasticità al substrato (enzima tipo MM irrev.) L’elasticità è indipendente da VM

Derivazione di εs per un enzima reversibile Ricordando che le espressioni cinetiche possono essere scritte spesso come (numeratore/denominatore) L’equazione per la MM reversibile è derivabile come quella irreversibile

Come semplificare le derivate

Ritorna al grafico εs L’elasticità al substrato di un enzima reversibile possiede due componenti: * Una di natura termodinamica che dipende da quanto la reazione è spostata dall’equilibrio * Una di natura cinetica che dipende da quanto l’enzima è saturato rispetto al substrato (prodotto) Derivando l’elasticità per il prodotto si trova:

Flux Control Coefficient (CJ) Cosa sono, a cosa servono e come posso misurarli X0  S1  S2  S3 …..  X1 E1 E2 E3 E4 … En v1 v2 v3 v4 … vn Se siamo allo steady state, v1 = v2 = v3 = v4 = vn = J Operiamo una variazione nell’enzima E2, quale sarà la variazione di J corrispondente?

Misura di CJ ΔE2  ΔJ δE2  δJ Operando una variazione piccola di J (ma sufficiente per una misura affidabile) ci avviciniamo alla derivata della curva J= J(E2) δE2  δJ

Questo non è sempre fattibile dal punto di vista sperimentale Per ogni flusso (reazione), ci sono tanti CJ quanti enzimi; (se ci sono più flussi…) Il tipo di definizione è simile a quella dell’elasticità, ma il CJ non è una proprietà di tipo locale, bensì di tipo sistemico Per misurare CJ con precisione occorre fare piccole variazioni nella quantità di un enzima (e uno solo!!) Questo non è sempre fattibile dal punto di vista sperimentale

Che forma avrà la curva J(E)? A valori bassi di E A valori alti di E

Derivata e derivata con scaling

CJ in un grafico log-log In questa zona la pendenza è 45% cioè il coeffic. Angolare (che è il CJ), è 1

La relazione enzima flusso in un caso reale:

CJaldolase in wt ≈ 0.24 (normal conditions) Photosynthesis (Calvin cycle) Haake et al. (1998) Plant J. 14:147-57 Reduction of plastidial aldolase (reaction close to equilibrium) Light 400 μmol/m2*s Enzyme (% wt) % reduct. Aldolase % inhibit. Photosynt. 35-78 10-45 CJaldolase in wt ≈ 0.24 (normal conditions) L’aldolasi plastidiale è un enzima che lavora vicino all’equilibrio ma che è limitante

Condition CJTK for wt plants 0.14 0.32 Light at 220, 350, 700 μE Reduction of plastidial transketolase (reaction close to equilibrium) Light at 220, 350, 700 μE Condition CJTK for wt plants CO2 amb., light at 220 μE 0.14 CO2 amb., light at 700 μE 0.32 La transketolasi è un enzima che lavora vicino all’equilibrio ma che è limitante

CJRubisco= 0.1 in wt conditions 57 100 (wt) “ Vmax 31.1 54.1 Activation % 93.5 62.5 Assimilation 6.35 6.80 CJRubisco= 0.1 in wt conditions La Rubisco è un enzima che lavora molto lontano dall’equilibrio e che NON è limitante

Flux control in photosynthesis A significant share of flux control is in enzymes ‘close to equilibrium’ Highly regulated enzymes working far from equilibrium show less flux control When light is switched on, flux increases:  many reactions are activated through changes in pH, Mg2+, redox status (thioredoxins), carbamylation, inhibitor degradation…  Attivazione parallela (no sign for a RLS!)

Una via metabolica reale: biosintesi di Trp in lievito Biosintesi del Triptofano in Saccharomyces cerevisiae: 5 enzimi trasformano l’Acido Corismico in Triptofano

A rigore le variazioni dovrebbero essere piccole… AAS (TRP2) PRT (TRP4) PRAI (TRP1) InGPS (TRP3) TrpS (TRP5) A rigore le variazioni dovrebbero essere piccole…

Due conclusioni importanti La figura testimonia due fatti: - I valori di CJ in vivo, nelle condizioni wt, sono bassi - Incominciano a salire solo per riduzioni notevoli della quantità di enzima (<50%) Due conclusioni importanti

Flux change: an asymmetric problem * Easy: Stopping flux to a product through a pathway. (Pick any enzyme; knock out by mutation or inhibition). * Hard: Increasing flux to a product through a pathway. * La sovraespressione non porterà un grande (quanto?) aumento nel flusso! * Molti enzimi hanno un CJ basso per cui una buona parte dell’attività di ciascuno di essi è dispensabile e questo significa che molte mutazioni sono recessive!

Verifica sperimentale della prima conclusione Provate a suggerire motivi per la discrepanza tra Δei e ΔJ Solo la simultanea espressione di molti (tutti) i geni causa un ΔJ paragonabile al ΔEi (ΔJ  CJ x ΔEi )

Alcune proprietà dei CJ Facciamo un esperimento con il pensiero… aumentiamo l’enzima E1 di una quantità δE1 es. incremento frazionario dell’1% (δE1 / E1)

Otterremo un aumento di flusso δJ, la cui entità sarà: indica l’aumento di flusso determinato dall’enzima 1 Immaginiamo di fare lo stesso per tutti gli enzimi δE5 δE3 δE4 δE1 δJ δJ δE2 δJ E1 E2 E3 E4 E5 J

A moment's reflection should show that such a change is equivalent to changing the time scale of the measurements: thus it should change all steady-state fluxes through the system by exactly a factor of α. Teorema della somma

Se la somma di tutti i coefficienti CJ deve valere 1, allora si spiega perché in una via metabolica molti (se non addirittura tutti) gli enzimi hanno un CJ basso! Questo darebbe ragione della recessività dei geni (95%)!!! (nessuna spiegazione alternativa rende ragione dei dati) Phenotype is flux! (non sempre…) Le spiegazioni basate sulla selezione delle mutazioni che non danno effetto negli organismi diploidi non reggono perché la stessa cosa vale per anche per quelli aploidi trasformati “artificialmente” in diploidi.

A cosa servono i CJ ? Ci permettono di predire il flusso in funzione della quantità di enzima. La bontà della predizione sarà tanto maggiore quanto più piccola sarà la variazione di enzima. ΔJ ΔE E1 E2 Viene però usata di solito questa formula per predire le variazioni di flusso, perchè l’approssimazione è minore

Se il flusso dipende dalla quantità di enzima con la legge di un’iperbole rettangola, …allora è possibile ricavare il CJ anche quando avvengono grandi variazioni di E (cosa che in genere non si può fare) Si usano in pratica i valori di E e di J non di “partenza”, ma di arrivo Note that this differs from the small-change estimate of the flux control coefficient in that the scaling factor is E2/J2, not E1/J1 (the ratio at the original operating point). A simple modification of MCA (Small & Kacser, Eur J Biochem 213: 613, 1993) improves the ability to handle the effects of large changes.  For a linear pathway, measurement of the two values of the flux, J1 and J2, at two widely separated levels of the enzyme, E1 and E2, allows calculation (to a good approximation) of the flux control coefficient at enzyme level E1 Usando questa formula si può derivare una formula più generale per predire le variazioni di flusso in funzione dell’entità della sovraespressione di un enzima:

Quando r è grande f flusso relativo Se sovrasprimo di 5 volte un enzima con CJ di 0.6, basta usare la curva “5” (r = 5) e trovare dove incontra la retta x=0.6, il risultato sarà un flusso relativo f~2

Coefficienti di controllo delle concentrazioni “j” è l’indice da far variare su tutti i substrati “i” è l’indice da far variare su tutti gli enzimi Ci dicono come varia la concentrazione dell’intermedio j-esimo (Sj) al variare della quantità di enzima i. Attenzione che non è l’inverso dell’elasticità. E’ di nuovo una proprietà sistemica e ve ne sono in totale: (n enzimi) x (m substrati)

Definizione formale di CS Ci dice come varia la concentrazione di un metabolita al variare di un enzima. Proprietà sistemica: variando anche un solo enzima è possibile che cambino TUTTI i metaboliti variabili Esistono n x m CS (n reazioni, m metaboliti)

Per i vari CS valgono relazioni analoghe al teorema della somma Se tutti gli enzimi aumentano in quantità (velocità) dello stesso fattore, quale sarà la variazione di SJ ? Vale 0!

Per ogni S la somma dei CS vale 0 Teorema della somma Che significato ha?  Alcuni enzimi aumentano la concentrazione di SJ  Altri enzimi diminuiscono la concentrazione di SJ

Referenze Continua... Per il concetto di elasticità, vedi Fell “understanding the control of Metabolism”, 1997 cap. 5; Vedi anche il cap. 10 di “Fundamentals of Enzyme kinetics”,  di A. Cornish Bowden Go to chapter 10 “Fundamentals of enzyme kinetics” Ottima ed approfondita (anche sin troppo in certi capitoli) panoramica sulla MCA: Hofmeyr, Snoep and Westerhoff (2002) Kinetics, Control and Regulation of Metabolic Systems (disponibile da me il file Snoep+Westerhoff.pdf) Rohwer and Hofmeyr (2010) Kinetic and Thermodynamic Aspects of Enzyme Control and Regulation. J. Phys. Chem. B, 114:16280–16289. Continua...

Referenze Articolo sulla via del Trp in Saccharomyces: Niederberger P, Prasad R, Miozzari G, Kacser H. (1992) A strategy for increasing an in vivo flux by genetic manipulations. The tryptophan system of yeast. Biochem J. 287:473-9. Per il concetto di CJ e di elasticità: Fell “understanding the control of Metabolism”, 1997 cap. 5; vedi anche http://bip.cnrs-mrs.fr/bip10/mca3.htm#1 e http://bip.cnrs-mrs.fr/bip10/mca4.htm Per la dimostrazione dei teoremi si veda anche la ristampa dell’articolo originale: Kacser, Burns, Fell (1995) The control of flux. Biochem. Soc. Trans. 23, 341-366 Vedi anche il cap. 10 di “Fundamentals of Enzyme kinetics”,  di A. Cornish Bowden Go to chapter 10 “Fundamentals of enzyme kinetics”