Chip a DNA: un esempio pratico Alessia Stell Laboratorio A. Maggi 9 Novembre 2010

Microarray e Tiling Arrays Chip a DNA Cosa sono Come si producono Microarray e Tiling Arrays Quali utilizzi hanno

Cosa sono i chip a DNA I chip a DNA sono costituiti da un array di microscopiche aree, ciascuna contenente 107 sonde identiche di 20-50 pb, covalentemente fissate al supporto (vetro, plastica, silicio o beads di polistirene) Sfruttano una tecnica di ibridazione inversa: le probe sono fissate al supporto (in una posizione nota), mentre i frammenti di DNA da analizzare (target) sono marcati con biotina o con marker fluorescenti e ibridizzati alle sonde Il DNA target, legato alla sonda, può essere identificato utilizzando uno scanner, capace di rivelare il segnale emesso

Cosa sono i chip a DNA I chip a DNA sono costituiti da un array di microscopiche aree, ciascuna contenente 107 sonde identiche di 20-50 pb, covalentemente fissate al supporto (vetro, plastica, silicio o beads di polistirene) Sfruttano una tecnica di ibridazione inversa: le probe sono fissate al supporto (in una posizione nota), mentre i frammenti di DNA da analizzare (target) sono marcati con biotina o con marker fluorescenti e ibridizzati alle sonde Il DNA target, legato alla sonda, può essere identificato utilizzando uno scanner, capace di rivelare il segnale emesso

Cosa sono i chip a DNA I chip a DNA sono costituiti da un array di microscopiche aree, ciascuna contenente 107 sonde identiche di 20-50 pb, covalentemente fissate al supporto (vetro, plastica, silicio o beads di polistirene) Sfruttano una tecnica di ibridazione inversa: le probe sono fissate al supporto (in una posizione nota), mentre i frammenti di DNA da analizzare (target) sono marcati con biotina o con marker fluorescenti e ibridizzati alle sonde Il DNA target, legato alla sonda, può essere identificato utilizzando uno scanner, capace di rivelare il segnale emesso

Come si producono FOTOLITOGRAFIA (in situ): Fasci di luce e maschere fotolitografiche sono utilizzati per produrre le sonde direttamente sul supporto; SPOTTED MICROARRAYS: Le sonde sono sintetizzate prima della loro deposizione sull’array, e solo successivamente “spottati” sul supporto.

Microarray e Tiling array MICROARRAY DI ESPRESSIONE: le sonde utilizzate rappresentano porzioni di trascritti noti Gene 1 Gene 2 TILING ARRAYS: coprono l’intero genoma o porzioni definite di genoma (tutti i promotori, solo alcuni cromosomi…) Gene 1 Gene 2

Quali utilizzi hanno MICROARRAY DI ESPRESSIONE: utilizzati quasi esclusivamente per l’analisi dei livelli di espressione di trascritti noti, confrontata in diverse condizioni (es. controllo-trattamento, cellula sana-cellula tumorale etc.) Gene 1 Gene 2 TILING ARRAYS: Utilizzati per analisi unbiased dell’espressione genica (geni non noti e miRNA); ChIP-on-chip (chromatin immunoprecipitation on a chip) Array CGH (comparative genomic hybridization): tecnica usata in diagnostica per l’individuazione di copy number variations e anomalie del DNA Gene 1 Gene 2

Il mio esperimento da dove siamo partiti dove volevamo arrivare quali tecnologie abbiamo usato I gruppi sperimentali

Da dove siamo partiti Gli estrogeni sono i principali ormoni sessuali nella donna ed influenzano la fisiologia femminile sotto vari aspetti Gli estrogeni permeano nelle cellule e legano il loro specifico recettore, una proteina intracellulare che , una volta attivata, è in grado di dimerizzare e attivare la trascrizione di specifici geni

Da dove siamo partiti Il modello animale utilizzato nel nostro laboratorio per lo studio dell’attivazione del recettore degli estrogeni in vivo è il modello ERE-Luc

Da dove siamo partiti Con questo modello abbiamo osservato l’attività del recettore degli estrogeni in condizioni fisiologiche nell’animale femmina ciclante, e ci siamo focalizzati sullo studio del ruolo del recettore degli estrogeni nel fegato

Femmine adulte ciclanti dove volevamo arrivare Prepuberi Femmine adulte ciclanti > 22 mesi (menopausa) Gravide

Microarray di espressione quali tecnologie abbiamo usato Microarray di espressione Analisi delle differenze di espressione genica nelle due diverse condizioni I livelli di estrogeni circolanti influenzano l’espressione genica? Quali sono i geni differenzialmente espressi? Tiling Arrays Analisi delle regioni di binding sulla cromatina di ERalfa nelle due diverse condizioni Dove si localizza ERalfa? La sua localizzazione è influenzata dagli estrogeni circolanti?

I gruppi sperimentali METESTRO Bassi livelli di estrogeno circolante PROESTRO Alti livelli di estrogeno circolante

Microarray Workflow Output Analisi dei Dati Risultati

Workflow Congelamento Estrazione RNA Microarrays Marcatura Ibridazione Retrotrascrizione Microarrays Marcatura Ibridazione

Output Quasi 40.000 trascritti conosciuti

Output I dati grezzi vengono raccolti in un file: File CEL E normalizzati: file RMA … e analizzati grazie all’aiuto del team di bioinformatici

Lista dei geni individuati Output Met > Pro Pro Livello E2 Met Lista dei geni individuati Met < Pro

CATEGORIE DI GENE ONTOLOGY Analisi dei dati Come otteniamo informazioni da questa lista di geni? Analizzandoli uno ad uno…. … o utilizzando specifici software che consentono di ottenere in modo semplice informazioni sulla funzione dei geni identificati CATEGORIE DI GENE ONTOLOGY

Analisi dei dati GENE ONTOLOGY: può essere considerato una specie di enciclopedia che raccoglie tutte le informazioni disponibili sui geni noti, attraverso delle definizioni e delle parole chiave condivise. E’ suddiviso in 3 categorie: Processi biologici Funzioni molecolari Componenti cellulari Un prodotto genico ha una o più funzioni cellulari, può essere coinvolto in diversi processi biologici e infine potrebbe essere associato a diversi compartimenti cellulari. http://www.geneontology.org/ http://www.geneontology.org/GO.tools.browsers.shtml http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp

Risultati 16% Met > Pro Met < Pro BIOSINTESI DEI LIPIDI e COLESTEROLO (pVal=5.10 e-6) A B C D E F DETOXIFICATION (pVal=1.20 e-4) G H 16% Met > Pro REGOLAZIONE della TRASCRIZIONE dell’mRNA (pVal=4.80 e-2) I L M Met < Pro

Risultati Biosintesi degli acidi grassi Biosintesi del colesterolo TG Ciclo Krebs B Z X W J Y C E D …. F TG

Workflow e messa a punto ChiP On chip Workflow e messa a punto Output Analisi dei dati Risultati

Workflow e messa a punto Crosslinking Workflow e messa a punto Sonicazione Immunopre- cipitazione 500 100 Crosslinking inverso Purificazione DNA Y ChIP-chip LM-Amplification Frammentazione Marcatura Ibridazione

Output Cutoff 1. Rilevazione del segnale relativo alle sequenze Chipped, e posizionamento sul DNA 2. Definizione dei picchi relativi alle regioni di binding tramite specifico algoritmo 3. Normalizzazione e analisi dei picchi che superano il limite di cutoff

Output Chr 10 23476246 23477332 BED file

Analizzandoli uno ad uno…. Analisi dei dati http://cistrome.dfci.harvard.edu/ap/ Analizzandoli uno ad uno…. … chiedendo l’aiuto dei bioinformatici che hanno creato di sicuro qualche software che ti sarà d’aiuto

Analisi dei dati > > > > Dove si localizzano (cromosomi) Chr 10 > > > > Dove si localizzano (cromosomi) Dove si localizzano rispetto a geni noti Quali sequenze legano Quali sono i geni che si trovano nelle vicinanze? http://genome.ucsc.edu/

Risultati 553 siti di binding 444 siti di binding 15%

Risultati Proestro Metestro 12% 18% 27% 28% 51% 58% Geni che presentano un sito di binding a PROESTRO nell’intorno di 20kb Regolazione dell’espressione genica (pVal=8.50 e-5) Regolazione dell’attività riproduttiva (pVal=3.90 e-4) Geni che presentano un sito di binding a METESTRO nell’intorno di 20kb Metabolismo dei lipidi e del colesterolo (pVal=1.30 e-3) Reagolazione dell’attività riproduttiva (pVal=1.40 e-3)

Come vengono utilizzati i dati ottenuti nei due esperimenti? Significato biologico Real time PCR Esperimenti sull’animale

Real Time PCR I geni epatici coinvolti nel metabolismo degli acidi grassi e del colesterolo mostrano un andamento regolare durante il ciclo regolato dalla fluttuazione di estrogeni circolanti Fatty acid biosynthetic pathway Cholesterol biosynthetic pathway

Real Time PCR I geni epatici coinvolti nel metabolismo lipidico e del colesterolo appaiono sregolati durante le diverse fasi fisiologiche della vita di una donna

Femmine adulte ciclanti Successivi esperimenti sull’animale Il livello di espressione dei geni epatici coinvolti nel metabolismo lipidico e del colesterolo appaiono sregolati durante le diverse fasi fisiologiche della vita di una donna Prepuberi Femmine adulte ciclanti > 22 mesi (menopausa) Si modifica anche il contenuto di lipidi del sangue e del fegato? Qual è la conseguenza biologica? Come può essere ripristinato il profilo lipidico corretto? Gravide

Grazie dell’ attenzione alessia.stell@unimi.it