CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO AA 2010-11 BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE Silenziamento genico

Nuovi target farmacologici: GLI ACIDI NUCLEICI FARMACI TRADIZIONALI DNA duplicato DNA RNA PROTEINA Duplicazione Trascrizione Maturazione Metabolismo Traduzione

ACIDI NUCLEICI COME TERAPEUTICI ANTISENSO: desossinucleotidi complementari con l’m-RNA ANTIGENE: desossinucleotidi complementari al DNA RIBOZIMA: ribonucleotidi catalalitici complementari a RNA APTAMERI: desossi e ribonucleotidi complementari a una sequenza aminoacidica (competono con l’RNA nella interazione tra RNA e proteina) DECOY: DNA complementare a sequenze aminoacidiche (competono con sequenze di DNA nell’interazione DNA- proteina) siRNA: RNA complementari a sequenze specifiche

RNA Interference: il processo attraverso il quale un RNA a doppio filamento interferisce con l’espressione genica: sia inducendo la degradazione di RNA complementare che bloccandone la traduzione http://www.nature.com/focus/rnai/animations/index.html

Silenziamento Post-trascrizionale (1990) Jorgensen 1990: Introduzione di transgeni responsabili della pigmentazione della petunia per ottenere petunie più scure pigmentazione ridotta del 40% nelle petunie transgeniche ridotta espressione sia del gene endogeno che del transgene (cosoppressione) A variegated petunia. Upon injection of the gene responsible for purple colouring in petunias, the flowers became variegated or white rather than deeper purple as was expected.

1993: Viene identificato il primo miRNA nel C. elegans 1998: Fire e Mello descrivono la presenza di RNA interference nel C. elegans 1999: il silenziamento genico nelle piante è accompagnato dall’accumulo di piccoli frammenti di RNA (20-25 Nt) complementari al gene silenziato. dsRNAs vengono ridotti a piccoli frammenti di 21-23 Nt 2001: Tuschl et al. dimostrano nella Drosophila che una piccola sequenza di RNA può interferire in modo specifico con la trascrizione

Andrew Z. Fire Craig C. Mello University of Massachusetts The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006 "for their discovery of RNA interference - gene silencing by double-stranded RNA"                          Andrew Z. Fire Craig C. Mello University of Massachusetts Stanford University b. 1959 b. 1960

Small RNAs miRNA siRNA Prodotti in modo endogeno Funzione: regolazione dell’espressione genica sopprimendo la traduzione o la trascrizione di geni target Exo-siRNA:Introdotti in modo esogeno (virus a dsRNA, transposoni, transgeni) Endo-siRNA: derivati da loci genomici endogeni Funzione principale: rispondere alle minacce esterne sopprimendo la trascrizione genica dell’”invasore”

Interferenza basata su RNA (RNA interference) Attori: Micro RNA (miRNA) precursori a forcina Small interfering RNA (Si) (2 nt 3’ protrundenti) Ribonucleasi DICER RISC (RNA driven interference silencing complex) che comprende: Argonaute, la proteina che srotola il doppio filamento e la ribonucleasi che taglia la sequenza senso a 10-11 nt dal terminale 5’.

Il complesso RISC attivato riconosce sequenze complementari di RNA, le lega e degrada: questo puo’ avvenire diverse volte in quanto l’RNA antisenso, protetto dal complesso proteico è stabile e in cellule che si dividono lentamente puo’ agire per 3-7 giorni.

RNA lungo a doppio filamento shRNA plasmidico siRNA sintetico a doppio filamento miRNA endogeno 20-25 NT Formazione del complesso RISC (RNA induced silencing complex) Amplificazione RNA-dip RNA polimerasi Complesso RISC attivato funzione miRNA funzione siRNA Blocco traduzione Formazione doppia elica con RNA complementare e attacco di endonucleasi

Risc unwinds dsRNA, the ribonuclease in the                                                                       Risc unwinds dsRNA, the ribonuclease in the Ribonuclease complex hydrolizes new targets

LOCI NATURALI CHE GENERANO siRNA Nature Reviews Genetics 2007, 8:884

Attività di siRNA a livello del nucleo Metilazione di citosine in frammenti di DNA complementari (descritta in vegetali) Riorganizzazione della cromatina (descritto in lievito, cellule vegetali e di insetto: siRNA determinano la metilazione di istoni e la formazione di eterocromatina) Excisione programmata di DNA in eccesso (protozoi)

RNA-directed DNA methylation (descritta in vegetali)

RNA interference-mediated heterochromatin assembly siRNAs are thought to guide histone methyltransferases (HMTs) to the chromatin to modify histone H3 on lysine 9 (H3K9). The methylated form of H3 is bound by Swi6 or HP1, which also associates with the methyltransferases, to maintain the silenced state. m, methyl group. Marjori A. Matzke & James A. Birchler Nature Reviews Genetics 6, 24-35 (January 2005

si RNA – caratteristiche RNA a doppia elica di 21-23 nt Presenza di terminale 3’ più lungo di 2nt Presenza di gruppi OH in 3’ Presenza 5’ fosfato Alta stabilità nella porzione 5’ senso(ricco in GC) Bassa stabilità nella porzione 5’ antisenso(ricco UA) Bassa stabilità nella zona centrale dove deve avvenire l’attacco della endonucleasi 2’ desossitimidina per proteggere siRNA da attività esonucleasiche Non deve essere complementare a zone introniche Complementare a una porzione di RNA a non più di 75 basi da codone di inizio trad.

si RNA – caratteristiche

siRNA possono diffondere per brevi e lunghe distanze Piante: siRNAs prodotti da Dicer-like 4 nel floema raggiungono 10-15 cellule fuori dal floema dove possono originare dsRNA (atraverso una RNA Pol RNA dip) che vengono processati in siRNAs secondari che propagano il silenziamento con un processo di amplificazione Animali: trasporto attraverso vescicole secretorie (esosomi)

In rosso: siRNA marcato In blu: nuclei In verde la proteina GAPDH CELLULE HeLa si RNA non specifico si RNA contro GAPDH Trattamento: 48h

siRNA come agenti terapeutici LA DISTRIBUZIONE Problematiche tipiche delle molecole di grandi dimensioni e che sono altamente polari Difficoltà ad ottenere distribuzione tessuto specifica Degradabilità dovuta a RNasi circolanti (RNA naturale puo’ essere utilizzato in cervello e polmoni) Ideale per applicazione topica (occhi, derma, tumori localizzati)

siRNA come agenti terapeutici LA SOMMINISTRAZIONE

siRNA come agenti terapeutici LA SOMMINISTRAZIONE Applicazione topica: instillazione di gocce, aerosol, iniezione intratumorale Somministrazione sistemica: iv (molecole di circa 5nm riescono a passare le membrane, fino a 200 nm passano solo capillari fenestrati : uso di nanocarrier) RNA di sintesi modificati per migliorarne la farmacocinetica Utilizzo di vettori virali e non per esprimere l’RNA della cellula bersaglio

siRNA come agenti terapeutici LA SOMMINISTRAZIONE Modificazione delle molecole di siRNA per una distribuzione più efficiente modificazioni per evitare le difese immunitarie (modificazione con 2’-o-metile nel filamento antisenso) fosforotionati per bloccare esonucleasi coniugazione con peptidi, colesterolo, PEG

Metodi di somministrazione: FISICI Iniezione idrodinamica: efficace in epatociti ma invasiva Elettroporazione: campo elettrico che facilita la transfezione di acidi nucleici, utilizzata in vivo nel muscolo, retina, giunture artritiche e tumori DI CONIUGAZIONE

Carrier mediated methods Stable nucleic acid lipid particle

BIODISTRIBUZIONE

Anton P. McCaffrey*, Leonard Meuse*, Thu-Thao T. Pham*, Douglas S. Conklin†, Gregory J. Hannon†, Mark A. Kay* Nature, 2002

siRNA IN STUDI CLINICI

Potenziali effetti collaterali della terapia con siRNA: Attivazione del sistema immunitario Effetti off-target Saturazione di vie di silenziamento endogene (miRNA)

Similarità e differenze con oligonucleotidi antisenso Similarità: - lunghezza - metodologia di delivery comune - induzione di silenziamento genico a livello post-trascrizionale - digestione di RNAm bersaglio da parte di endonucleasi - possibilità di stabilizzazione con basi modificate - similarità nella biodistribuzione Differenze: - doppio filamento verso singolo filamento - maggiore stabilità della molecola naturale - maggiore efficacia in cellule in coltura - meccanismo di azione mediato da RISC

FUNZIONI FISIOLOGICHE DEI miRNA Mantenimento dell’identità cellulare (es. pluripotenza)  L’identità cellulare viene mantenuta silenziando mRNAs che non appartengono allo specifico repertorio della cellula Network di miRNA che controllano specifici pathway (miR-21 regola miRNA che controllano apoptosi: disregolazione di miR-21 cancro. miRNA che controllano la via di segnale dell’insulina, diverse tipologie cellulari hanno maggiore o minore necessità di glucosio quindi il funzionamento di questo network di miRNA è regolato a seconda della tipologia cellulare)

miRNA e cancro Tumori: pattern specifico di espressione dei miRNA che permettono di discriminare i diversi tipi di cancro e di identificare il tessuto di origine delle metastasi

Network trascrittoma-microRNA nel cancro

miRNA e cancro miRNA oncogeni: miRNA overespressi nei tumori (es. miR-155 è upregolato in tumori maligni del sistema ematopoietico, della mammella, del polmone e del pancreas, miR-380-5p reprime p53 nel neuroblastoma, antagonizzandolo con un oligonucleotide antagonista migliora la prognosi)  blocco dei miRNA con oligonucleotidi antisenso miRNA oncosoppressori: miRNA ridotti o mancanti nei tumori. La loro overespressione limita la proliferazione o induce apoptosi (es. miR-15a-16-1, downregolato in cellule B di pazienti con leucemia linfocitica cronica, adenomi della prostata e dell’ipofisi)  miRNA mimics o vettori virali

Strategie per terapie anti-cancro basate su miRNA: Bloccare miRNA oncogeni usando oligonucleotidi antisenso Costrutti Locked nucleic acid (LNA) miRNA sponges miR-mask Small molecule inhibitors Ripristinare l’espressione di miRNA oncosoppressori Riprogrammare le cellule cancerogene

Limiti e vantaggi della terapia con miRNA

Riferimenti bibliografici Chapman E and Carrington J. Specialization and evolution of endogenous small RNA pathways. Nature Rewievs Genetics 2007, 8:884 Iorns E et al. Utilizing RNA interference to enhance cancer drug discovery. Nature Rewievs Drug Discovery 2007, 6:556 Kawakami S. and Hashida M. Targeted delivery of small interefering RNA by systemic administration. Drug Metab. Pharmacokin 2007, 22: 142 Kathryn A. Whitehead, Robert Langer & Daniel G. Anderson Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nature Reviews Drug Discovery 8, 129-138 (February 2009) Carthew et al., Origins and mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell vol 136, Feb 2009 Garzon et al., Targeting microRNAs in cancer: rationale, strategies and challenges. Nat reviews vol 9 (2010) Semple et al., Rational design of cationic lipids for siRNA delivery. Nat Biotech vol 28 Feb. 2010 Kosik et al., MicroRNAs and cellular Phenotipy, Cell vol 143, 2010