MECCANISMO E DANNO DA RIPERFUSIONE 5a GIORNATA DELLA RICERCA SULL’ICTUS Corso di aggiornamento professionale Materiale didattico a cura di: Alberto Chiarugi e Domenico Inzitari

Major types of stroke and cerebral accident Green et al. TIPS 24: 402, 2003

Strategie terapeutiche per lo stroke acuto RIPERFUSIONE (approccio vascolare) ( Flusso ematico) Edema tissutale Trombolisi Angioplastica Endarterectomia Emodiluizione NEUROPROTEZIONE (approccio parenchimale ( vulnerabilità del tessuto) Eccitotossicità ([Ca2+]i, [Zn2+]i?) Radicali liberi Infiammazione Apoptosi …… La terapia del danno ischemico cerebrale si distingue shematicamente in un approccio mirato alla riperfusione vascolare con l’impiego di agenti fibrinolitici e meccanici e in un approccio farmacologico volto alla protezione del parenchima cerebrale grazie all’utilizzo di agenti chimici capaci di ridurre direttamente i fenomeni neurodegenerativi che avvengono all’interno delle cellule neuronali. In questa presentazione si tratterà esclusivamente della possibilità di un approccio farmacologico alla neuroprotezione ischemica, tralasciando l’argomento della riperfusione vascolare.

Dinamiche spazio-temporali dello sviluppo e dell’evoluzione del danno ischemico cerebrale Evoluzione spaziotemporale dell’infarto cerebrale. Classicamente la zona a valle dell’occlusione vasale si distingue in due porzioni chiamate “core ischemico” e “penombra ischemica”. Mentre il primo è caratterizzato da assenza si flusso ematico e va incontro velocemente a necrosi colliquativa, la zona di penombra di caratterizza per avere dei ridotti valori di perfusione (oligoemia) senza però manifestare evidenze di edema o necrosi. Con l’andare del tempo, in assenza di riperfusione, il core ischemico si allarga inesorabilmente fino ad inglobare la zona di penombra. É quest’ultima quindi il principale bersaglio della neuroprotezione ischemica.

I° Parte Meccanismo e Strategie della Riperfusione

Riperfusione E’ dimostrato che il rapido ripristino del flusso ematico cerebrale in caso di occlusione vascolare acuta può determinare il completo recupero della funzionalità del tessuto cerebrale La riperfusione del tessuto ischemico può avvenire attraverso 3 meccanismi: Ricanalizzazione spontanea Trombolisi farmacologica e/o meccanica Collaterali leptomeningei A 15 anni dall’avvento delle prime terapie trombolitiche, numerosi studi e la pratica clinica hanno confermato il beneficio della riperfusione precoce

Trombolisi Sistemica, endovenosa: rtPA 0.9 mg/kg entro 3 ore dall’esordio. Endovascolare, intrarteriosa rtPA, urokinasi Meccanica

Fibrinolisi farmacologica tPA Prodotto dalle cellule endoteliali Ha recettori sulla fibrina Si lega alla annessina II sulla superficie endoteliale Urokinasi Prodotto da tutte le cellule nucleate Non ha recettori sulla fibrina Ha recettori sulla superficie cellulare

Alcuni studi clinici di trombolisi endovenosa nello stroke NINDS I e II 1995 rt-PA <3 h migliora outcome 3 mesi, aumenta rischio ICH ECASS I 1995 rt-PA <6h ± outcome, aumenta rischio ICH ECASS II 1998 rt-PA <6h ± outcome aumenta rischio ICH ECASS III 2008 rt-PA 3-4,5 h migliora outcome 3 mesi, aumenta rischio ICH ATLANTIS A 1999 rt-PA 3-5 h NON migliora outcome 3 mesi, aumenta rischio ICH ATLANTIS B 2002 rt-PA <3 h migliora outcome 3 mesi, aumenta rischio ICH DEFUSE 2006 rt-PA 3-6 h DWI/PWI mismatch migliora outcome se DWI<80% PWI (41% casi) EPITHET 2008 rt-PA 3-6 h DWI/PWI mismatch NON riduce volumi infartuali, > % riperfusione SITS-MOST 2007 rt-PA <3h migliora outcome 3 mesi, aumenta rischio ICH DIAS I (fase 2) 2005 desmotelpase 3-9 h DWI/PWI mismatch>1.2 migliora outcome e riperfusione DEDAS (fase 2) 2006 desmotelpase 3-9 h DWI/PWI mismatch>1.2 migliora outcome e riperfusione DIAS II (fase 3) 2009 desmotelpase 3-9 h NON migliora outcome Ogni 1000 pz che ricevono rt-PA entro 3 ore 140 evitano la morte o dipendenza a 3 mesi Ogni 1000 pz che ricevono rt-PA entro 6 ore 57 evitano la morte o dipendenza a 3 mesi IST-3……………ongoing………..efficacia rt-PA <6h, pz >80 aa

TROMBOLISI INTRA-ARTERIOSA Evidenza scientifica minore rispetto alla trombolisi endovenosa. Prevede la disostruzione del vaso mediante somministrazione di farmaci fibrinolitici (urokinasi) direttamente alla superficie del coagulo e/o manovre di trombectomia meccanica. Ictus emisferici gravi, > 6h Trattamento non approvato, richiede approvazione da parte dei comitati etici locali PROACT-1 r-pro-urokinasi 6 mg <6h occlusione prossimale ACM Studi clinici PROACT-2 r-pro-urokinasi 9 mg ± eparina <6h occlusione prossimale ACM r-proUK Controlli Pazienti (121) (59) Rankin 0,1,2 a 90 gg 40% 25% Morte 24% 27% Emorragie a 10 gg 50% 48% Emorragie sintomatiche 12% 3.6% Ricanalizzazione vaso 67% 18% Ogni 1000 pz che ricevono rpro-UK-PA entro 6 ore 15 evitano la morte o dipendenza a 3 mesi La trombolisi intrarteriosa nell’occlusione della a. basilare non modifica l’outcome Sono necessari studi clinici che confrontino sicurezza ed efficacia di trombolisi i.a. e e.v. nell’occlusione della ACM e AB

TROMBOLISI MECCANICA MERCI retriever Dispositivo in nitinol che assume una conformazione ad elica quando fuoriuscito dal catetere guida Angioplastica + Stent intracranico Manovre di tromboaspirazione

PTA + Trombolisi (Urokinasi 500,000 IU) in pz con occlusione dell’ arteria cerebrale media Controllo a 24 ore: ricanalizzazione completa

Trombolisi combinata (Sistemica+ Locoregionale) Nella terapia dell’ ictus grave da occlusione di grossi vasi prossimali Razionale: associare la rapidità di inizio trattamento della trombolisi SISTEMICA alla maggiore efficacia di ricanalizzazione sui grossi vasi prosssimali della INTRA-ARTERIOSA. Come intervento di salvataggio in caso di insuccesso della trombolisi ev

EFFETTO PLEIOTROPO del tPA Topi Knock-out tPA mostrano lesioni ischemiche di minor dimensione. (Wang YF et al Nature Med 1998) amplificano neurotossicità NMDA mediata in corso di ischemia (Nicole O et al Nature Med 2001) Proteolisi della matrice Aumento espressione MMP9 (Wang X et al Nat Med 2003) Lisi del coagulo in modelli murini di ischemia da occlusione CM infusione tPA esogeno non peggiora outcome (Klein GM et al Neurology 1999) Effetto vasoattivo (Nasser T et al Blood 2004) Rimodellamento matrice recupero DANNO TISSUTALE LISI DEL COAGULO

Agenti trombolitici studiati nella riperfusione in seguito a stroke ischemico rt-PA (alteplase) Duteplase Reteplase u-PA (urokinase) SK (streptokinase) TNK (tenecteplase) DS-PA (desmoteplase) Plasmin Microplasmin …in associazione ad antiaggreganti rt-PA (alteplase) + GPIIb/IIIa antagonists + Tirofibran Eptifibatide (studio CLEAR) Eptifibatide + aspirina + Tinzaparina (studio ROSIE-2) …in associazione ad anticoagulanti rt-PA (alteplase) + anti-trombina Argatroban (studio TARTS) …in associazione a ultrasuoni (sonotrombolisi) rt-PA (alteplase) + 2-MHz Doppler Transcranico (studio CLOTBUST)

II° parte DANNO DA RIPERFUSIONE

Definizione Si parla di danno da riperfusione quando la circolazione sanguigna torna al tessuto dopo un periodo di ischemia causando danno al tessuto stesso invece della ripresa della normale funzionalità. A livello cerebrale….. Gli effetti della riperfusione non sono solo e sempre positivi. La riperfusione tissutale che segue la trombolisi o l’embolectomia innesca una cascata di eventi molecolari che risultano lesivi per il parenchima cerebrale. Parte del tessuto ischemico cerebrale, soprattutto quello a livello della “penombra ischemica” è ancora vitale al momento della trombolisi ma, paradossalmente, muore durante la riperfusione Definizione di danno da riperfusione a livello sistemico e cerebrale

ISCHEMIA RIPERFUSIONE Il Reperfusion Battleground: La riperfusione blocca e al tempo stesso peggiora il danno indotto dall’ischemia Cellule(%) 100 potenzialmente vitali definitivamente non vitali non vitali uccise dalla riperfusione “Reperfusion injury” salvate dalla riperfusione “Reperfusion battleground” Visualizzazione schematica dell’evolversi della morte cellulare durante l’ischemia e la riperfusione. Si noti che la riperfusione causa una perdita della cellule potenzialmente vitali. Il “Reperfusion Battleground” non è altro che l’equilibrio dinamico tra le azioni benefiche e citotossiche della ripefusione. ISCHEMIA RIPERFUSIONE

Il danno da riperfusione contribuisce al fenomeno del “No Reflow” Ischemia Danno endoteliale Edema tissutale “No Reflow” Riperfusione Attivazione piastrinica riperfusione ischemia Radicali liberi dell’ossigeno Attivazione leucocitaria ateroembolismo Ateroembolismo Il fenomeno del No Reflow, evento deleterio per il tessuto ischemico, è causato dal susseguirsi di ischemia, riperfusione e fenomeni di ateroembolismo che nell’insieme provocano danno endoteliale, attivazione piastrinica e leucocitaria e formazione di radicali dell’ossigeno. Questi promuovono l’edema del tessuto e circoli viziosi che amplificano il danno vasale con blocco del flusso ematico

I mediatori del danno da riperfusione Visualizzazione schematica dai meccanismi patogenetici del danno da riperfusione. Si evidenziano gli agenti scatenanti, i mediatori e gli effetti patologici no reflow edema danno barriera ematoencefalica emorragia iper-perfusione ipo-perfusione

DANNO DA RIPERFUSIONE: IL COSIDDETTO “OXYGEN PARADOX” In seguito alla trombolisi, la riperfusione ematica riporta i livelli di ossigeno tissutale a livelli fisiologici ma in un tessuto sofferente a causa del precedente insulto ischemico. Ne risulta una marcata formazione di radicali liberi dell’ossigeno, ROS, attraverso vari meccanismi. I principali sono: 1 – In tutte le cellule: diretta riduzione dell’ossigeno molecolare 2 – Endotelio: reazioni enzimatiche catalizzate da xantina ossidasi, ciclossigenesi, nitrossido sintetasi. 3 – Leucociti (soprattutto neutrofili attivati): mediante la NADPH-ossidasi (produzione di superossido nella fase tardiva della riperfusione) 4 - Cellule neuronali e gliali: a livello del complesso I e III della catena respiratoria mitocondriale (diretta formazione di superossido), ossidazione di metaboliti endogeni quali catecolamine e lipidi di membrana Spiegazione del meccanismo e sede di formazione dei ROS in seguito a riperfusione del tessuto ischemico cerebrale

Effetto dei ROS prodotti a causa della riperfusione ione superossido: O2- perossido d’idrogeno: H2O2 ossigeno singoletto O° perossinitrito ONOO- Perossidazione dei lipidi di membrana, con conseguente: aumento permeabilità: disionie, depolarizzazione danno reticolo sarcoplasmatico: blocco sintesi proteica, trafficking cellulare blocco della respirazione mitocondriale: crisi energetica, aumentata produzione di ROS (circolo vizioso) Ossidazione delle proteine, con conseguente : alterazione dei canali ionici e pompe ioniche (Na+/K+ ATPasi, Ca++ ATPasi, scambiatore Na+/Ca++): disionie, depolarizzazione Danni agli acidi nucleici, con conseguente : blocco trascrizionale e innesco della cascata apoptotica Elenco delle specie radicaliche che si formano in seguito alla riperfusione cerebrale e dei loro bersagli

Danno da riperfusione e funzionalità endoteliale A livello delle arteriole di resistenza si verifica una perdita della risposta vasodilatatoria, NO mediata, ad acetilcolina e serotonina. Dopo la ricanalizzazione, il danno da ROS alle cellule endoteliali causa riduzione di rilascio di NO e aumentata formazione di superossido e endotelina A livello delle venule si verifica una risposta infiammatoria locale, mediata dai granulociti neutrofili attivati con successiva disfunzione endoteliale alterata permeabilità endoteliale ed aumento della pressione intracapillare determinano un aumento della filtrazione di fluidi nell’interstizio = edema tissutale Riassunto degli effetti della riperfusione a livello aretiolare e venulare. L’alterata permeabilità che si verifica porta a stravaso di liquidi e edema tissutale. Questi ultimi sono evidenziati dalle tre immagini angiografiche Basale 5’ Riperfusione 30’ Riperfusione

Danno da riperfusione: MRI imaging Visualizzazione spazio-temporale del danno da ripefusione del nel cervello di un ratto sottoposto a occlusione dell’arteria cerebrale media per 2 h e riperfusione. Si noti che all’aumento dell’ADC che segue la riperfusione segue una secondaria diminuzione che non si associa a riduzione di perfusione (PWI). Alla riduzione secondaria di ADC si associa un aumento della lesione ischemica. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism 20:1474–1482 © 2000

Danno da riperfusione: MRI imaging Visualizzazione spazio-temporale del danno da ripefusione del nel cervello di un ratto sottoposto a occlusione dell’arteria cerebrale media per 2 h e riperfusione. Si noti che all’aumento dell’ADC che segue la riperfusione segue una secondaria diminuzione che non si associa a riduzione di perfusione (PWI). Alla riduzione secondaria di ADC si associa un aumento della lesione ischemica. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism 20:1474–1482 © 2000

Danno da Riperfusione e Granulociti Neutrofili I Neutrofili sono la maggiore componente cellulare della risposta infiammatoria che contribuisce al danno da riperfusione Nel parenchima cerebrale post-ischemico sono i primi ad attivarsi, vengono rallentati dalle cellule endoteliali (rolling, grazie all’espressione di P-selectin endoteliale indotta dall’ O2-), aderiscono a queste(con CD11b e ICAM-1 endoteliale) e migrano nei tessuti (grazie all’espressione di PECAM-1 endoteliale), insieme ad una componente macrofagica e linfocitaria Vengono richiamati nel parenchima cerebrale (post)ischemico da componenti del sistema del complemento (C3a, C5a, MAC) e da mediatori rilasciati dall’endotelio stesso (PAF, TNFα, IL-8, HMGB1) Sono una importante fonte di: 1 - ROS che, innescando un circolo vizioso, aumentano l’adesione dei neutrofili stessi all’endotelio 2 - Enzimi proteolitici 3 - Citochine pro-infiammatorie, leucotrieni, prostanoidi Aumento permeabilità vascolare, edema, trombosi, morte neuronale Riassunto del ruolo patogenetico dei granulociti neutrofili nel danno da riperfusione

Stroke 1991;22;44-50 Dimostrazione preclinica del ruolo patogenetico dei granulociti neutrofili nel danno da riperfusione. In conigli sottoposti a ischemia riperfusione il trattamento con siero anti neurtrofili (colonne bianche) ma non anti-piastrine (colonne grigio scuro) è in grado di ridurre l’aumento della pressione endocranica (edema) che segue alla riperfusione (45 min dall’emboilizazione). Lo stesso siero favorisce il recupero del flusso ematico cerebrale e riduce il volume infartuale.

Danno da riperfusione e Barriera Ematoencefalica Early blood-brain barrier disruption in human focal brain ischemia Ann Neurol. 2004 Oct;56(4):468-77. In 144 ictus ischemici la perdita della barriera ematoencefalica (BBB) avviene nel 45% dei riperfusi e 18% dei non riperfusi Una prognosi infausta si verifica nel 63% nei pazienti con perdita di BBB e 25% nei pazienti con mantenimento della BBB La perdita di BBB è un forte predittore di trasformazione emorragica Evidence of reperfusion injury, exacerbated by thrombolytic therapy, in human focal brain ischemia using a novel imaging marker of early blood-brain barrier disruption. Stroke, 2004, 35:2659-61 La distruzuione della BBB si può evidenziare alla MRI come: HARM: “Hyperintense Acute Reperfusion Marker” Dopo circa 3 h dalla riperfusione è presente nel 33% dei pazienti ischemici e si associa a trasformazione emorragica e cattiva prognosi. La riperfusione è il principale predittore di distruzione della BBB. Ruolo patogenetico del danno alla barriera ematoencefalica (BBB) in seguito a riperfusione. Il primo studio dimostra che esiste correlazione tra riperfusione e danno alla BBB e che quest’ultimo si associa a prognosi infausta e trasformazione emorragia. Il secondo studio, grazie ad un MRI con contrasto (Gadolinio), visualizza il danno alla BBB che segue la riperfusione definendolo con l’acronimo “HARM”. Questo si verifica nel 33% dei casi di riperfusione e, come per il primo studio, si associa ad aumentata probabilità di trasformazione emorragica e prognosi infausta.

Conclusioni Il danno da riperfusione: Si associa frequentemente alla riperfusione cerebrale E’ tanto maggiore quanto più tardiva è la riperfusione E’ causato da disfunzione endoteliale, formazione di radicali liberi e infiltrazione granulocitaria Può essere visualizzato con MRI nell’uomo A livello preclinico può essere ridotto con opportune tecniche capaci di bloccare i fenomeni patogenetici che ne stanno alla base (ROS, infiammazione) Tali strategie non hanno dato risultati analoghi nell’uomo Il suo contenimento è un obiettivo principale nell’ambito della terapia farmacologica dell’ictus ischemico, soprattutto alla luce di un possibile prolungamento oltre le 3 ore dell’attuale finestra di riperfusione

Le possibilità di una modulazione farmacologica della neurodegenerazione ischemica

I Patogenesi del danno ischemico cerebrale La diapositiva dimostra come in vari studi clinici con statine, l’incidenza dello stroke sia significativamente ridotta.

Target farmacologici per la neuroprotezione ischemica I – ECCITOTOSSICITA’ “If glutamate or another compound stimulating excitatory amino acid receptors, is present in synaptic clefts for a prolonged period of time it can kill cells on which it normally acts as a neurotransmitter” (Bruyn & Stoot) [Glu]o Morte neuronale eccitotossica ATP => [K+]o & [Na+]o Leakage FRs Meccanismi molecolari dell’eccessivo rilascio di glutammato Recettori al glutammato L’eccitotossicità è riconosciuta uno dei meccanismi chiave della neurodegenerazione ischemica. Il glutammato è il principale neurotrasmettitore eccitarorio ed attiva una serie di reccettori postsinaptici classicamente distinti in ionotropi (recettorio NMDA, AMPA e per il Kainato) e metabotropi (distinti in gruppo I-II-III). In corso di ischemia cerebrale, il deficit energetico causa depolarizzazione neuronale con rilascio sinaptico di glutammato. Lo stesso deficit energetico, a causa del blocco della pompa Na-K ATPasi, porta ad un accumulo di Na all’interno del neurone. In queste condizioni, il carrier responsabile del co-trasporto Na-glutammato all’interno de neurone lavora in modo inverso esportando nell’spazio intersinaptico Na e glutammato. Ne consegue un ulteriore accumulo di glutammato nella sinapsi con eccessiva attivazione dei recettori glutammatergici e morte cellulare eccitotossica.

Glutamate receptors Besancon et al., TIPS. 29: 268, 2008 Kalia et al., Lancet Neurol. 7: 742, 2008 Besancon et al., TIPS. 29: 268, 2008

NMDA-R: potential sites for drug action Kalia et al., Lancet Neurol. 7: 742, 2008

Eventi molecolari alla base della progressione del danno ischemico cerebrale: II – vie di morte tissutale Morte neuronale ischemica “Excyting, Radical, Suicidal” L’eccessiva attivazione dei recettori al glutammato porta ad un massivo aumento di Na e Ca2+ intracellulare. Il primo è responsabile del rigonfiamento cellulare e alterazione delle proprietà della membrana plasmatica. Il Ca2+ è invece in grado di attivare vari enzimi quali lipasi, proteasi e endonucleasi che contribuiscono alla distruzione delle strutture cellulari e alla necrosi eccitotossica. L’eccessivo aumento di ca2+ porta inoltre ala produzione di radicali dell’ossigeno e dell’azoto e a danno mitocondriale. Questi due eventi innescano dei circoli vizioni con ulteriorie accumulo di radicali liberi e distruzione delle strutture cellulari. La morte neuronale con rilascio di fattori intracellulari richiama in un secondo momento le cellule infiammatorie dal microcircolo ed attiva quelle residenti nel parenchima cerebrale, prima fra tutte la microglia. La risposta infiammatoria al danno ischemico cerebrale è a sua volta causa di innesco di circoli vizioni con produzione di fattori neurotossici e peggioramento del danno neuronale ischemico. Nelle cellule della penombra ischemica la sofferenza cellulare innesca fenomeni di morte apoptotica a tempi tardivi che non si ritengono responsabili del richiamo di cellule infiammatorie. Nel complesso il danno ischemico cerebrale riconosce vari meccanismi molecolari tossici che si susseguono e si sommano secondo dinamiche temporali abbastanza ben identificate. In ultima analisi, sulla base dei fenomeni fisiopatologici che si attivano nel parenchima cerebrale ischemico, la morte neuronale ischemica si può ricondurre a fenomeni di eccessiva eccitazione, massiva formazione di radicali e stress ossidativo nonchè alla attivazione di programmi di morte cellulare apoptotica.

Chronological sequence of mechanisms in post-ischemic neuronal death Zaleska et al., Neuropharmacology 56: 329, 2009

Target farmacologici per la neuroprotezione ischemica I – ECCITOTOSSICITA’ Esempi di passati trial clinici falliti con strategie anti-eccitotossiche Nonostante il ruolo causale dell’eccitotossicità nei fenomeni di neurodegenerazione ischemica sia da più parti confermato, numerosi trials clinic volti al contenimento del danno ischemico cerebrale mediante composti capaci di antagonizzare I recettori al glutammato hanno dato esito negativo. La diapositiva riporta dati del 1999. al momento anche I trials definiti ongoing sono falliti, così come nuovi trials iniziati successivamente. Lee et al., Nature 399 (supp): A7, 1999

Target farmacologici per la neuroprotezione ischemica II – STRESS OSSIDATIVO Ischemia cerebrale Radicali Superossido Idrossile Perossido d’idrogeno Ossigeno singoletto Malondialdeide Ossido nitrico Perossinitrito Attivazione dei reccettori glutammatercgici Disfunzione mitocondriale Ativazione della NADPH ossidasi Attivazione della nNOS Attivazione delle cellule infiammatorioe Danno tissutale Morte neuronale NXY-059 for acute stroke therapy: clinical trials CHANT (Cerebral Hemorrhage And NXY Treatment) A double-blind, randomized, placebo-controlled, parallel-group, multicenter, Phase IIb study to assess the safety and tolerability of 72 hours intravenous infusion of NXY 059 in adult patients with acute intracerebral hemorrhage (ICH). SAINT I (Stroke – Acute Ischemic – NXY Treatment) A Double Blind, Randomized, Placebo Controlled, Parallel Group, Multicenter, Phase IIb/III Study to Assess the Efficacy and Safety of Intravenous NXY-059 in Acute Ischemic Stroke. SAINT II (Stroke – Acute Ischemic – NXY Treatment) A Double Blind, Randomized, Placebo Controlled, Parallel Group, Multicenter, Phase IIb/III Study to Assess 26 October 2006: AstraZeneca Announces SAINT II Trial Results Showed No Efficacy in Acute Ischaemic Stroke NXY-059 (disufenton sodium) was discontinued from development following the results from the SAINT II (Stroke Acute Ischemic NXY-059 Treatment) trial, which showed that the investigational drug NXY-059 did not meet its primary outcome of a statistically significant reduction in stroke-related disability, as assessed by the Modified Rankin Scale (mRS) (p=0.33, odds ratio 0.94) compared to placebo. There was no evidence of NXY-059 lowering the incidence of symptomatic intracranial haemorrhage when administered with rt-PA (p=0.56). Mortality and the incidence and profile of adverse events in patients receiving NXY-059 were similar to placebo. Come precedentemente indicato, lo stress ischemico/eccitotossico attiva in maniera sregolata una serie di sistemi che finiscono col portare alla formazione di radicali liberi dell’ossigeno e dell azoto. Questi, sia come tali che reagendo tra loro (perossinitrito) inducono un danno ossidativo alle strutture lipidiche, proteiche e al DNA con conseguente citotossicità e morte neuronale. Il coinvolgimento dello strss ossidativo nel danno ischemico è da tempo riconosciuto e numerosi sono stati I trial clinici volti a verificare l’efficacia di radical scvengers nella terapia dello stroke acuto. Tra quaste molecole, il NXY-059 della Astra-Zeneca ha sollevato notevole entusiasmo per dei risultati preliminari positivi della neuroprotezione ischemica. Purtroppo, ulteriori indagini non hanno evidenziato un’efficacia del composto nella riduzione del danno ischemico cerebrale.

Target farmacologici per la neuroprotezione ischemica III- INFIAMMAZIONE Infiammazione placca ateromasica Stroke infiammazione peggioramento Infiammazione e stroke Attivazione astrociti/microglia Infiltrazione leucocitaria COX-2, iNOS, IL-1, TNF MCP-1 Il coinvolgimento della risposta infiammatoria nella patogenesi del danno ischemico cerebrale è supportato da numerosi dati perimentali che dimostrano l’effetto neuroprotettivo di agenti anti-infiammatori. Alcuni dei mediatori dell’infiammazione coinvolti della morte neuronale ischemica sono elencati nella diapositiva. Nell’uomo sono stati compiuti dei clinical trials che hanno dato risultati non positivi con l’eccezione degli antagonisti del recettore per l’IL1 beta. Al momento sono necessari ulteriri studi di fase III per poter meglio comprendere la reale efficacia di questo composto nonchè la rilavanza farmacoterapeutica di un contenimento dell’infiammazione nella terapia dello stroke acuto. CLINICAL TRIALS WITH ANTIINFLAMMATORY DRUGS AS STROKE NEUROPROTECTANTS - Leukocyte adhesion inhibition Anti-ICAM-1 antibody (enlimonab) (EAST) Adverse Effect HU23F2G – leukocyte adhesion inhibitor (HALT) No benefit - Inhibition of cytokines IL-1 R antagonist safe and effective

Target farmacologici per la neuroprotezione ischemica IV - APOPTOSI Nonostante sia indubbio che la neurodegenerazione ischemica comprenda una componente apoptotica, tardiva e prevalentemente legata all’attivazione della via intrinseca dell’apoptosi e quindi delle caspasi, al momento l’efficacia degli inibitori delle caspasi dimostrata in numerosi studi preclinici, non è stata indagata con trals clinici nell’uomo. VARI INIBITORI DELLE CASPASI CON DIFFERENTI STRUTTURE MOLECOLARI SPERIMENTALI NELL’ANIMALE Non sono mai stati compiuti clinical trials con inibitori delle caspasi L’entusiasmo si è notevolemente ridotto

II Alcuni studi clinici in corso con neuroprotettori nello stroke acuto La diapositiva dimostra come in vari studi clinici con statine, l’incidenza dello stroke sia significativamente ridotta.

Selected ongoing trials of neuroprotection Sacco et al., Lancet 369: 331, 2007

Recenti studi clinici per la neuroprotezione ischemica I – Citicolina (in corso) Cytidine-5’-diphosphocholine (Citicoline) Intermediate in the synthesis on phosphatidylcholine. Essential for the biosynthesis of membrane phospholipids Inhibits the activity of some phospholipases, Restores some enzymatic activities bound to neuronal membranes Elevates brain levels of some catecholamines. Membrane stabilization A Phase III trials showed modest efficacy Ongoing trial : ICTUS, started October 2006;  Expected completion: October 2011 1g/12h iv during 3 days and then orally until complete 6 weeks of treatment The previous clinical trials performed with citicoline were no conclusive, with some positive results. Data Analysis shows the odds ratio of achieving a complete recovery was 33 % higher in citicoline-treated patients than in placebo-treated patients, with the best response obtained with the dose of 2g/d/6 weeks. To determine the effects on recovery at 3 months of oral citicoline 2 g/d/6 weeks in patients with moderate/severe acute ischemic strokes in comparison with placebo. Vengono elencati adesso alcuni clinical trials che stanno ricevendo particolare attenzione nel campo della neuroprotezione ischemica. Tra questi, la citicolina, un precursore dei fosfolipidi di membrana sembra avere dato risultati positivi ed è approvato per il trattamento dello stroke in alcuni paesi. I dati definitivi si avranno alla fine del 2011.

Recenti studi clinici per la neuroprotezione ischemica II – Albumina umana (in fase di reclutamento) Enhances red cell perfusion and oxygen transport capacity, Reduces leukocyte adhesion within the brain micorcirculation, Endowed with antioxidant effects ALIAS (Recruiting) Starts: June 2006;  Expected completion: December 2009 Human Serum Albumin will be superior to placebo in improving the 3 month outcome of ischemic stroke patients when administered within 5 hours of symptom onset. Human serum albumin, at 2 g/kg, administered over 2 hours by intravenous infusion will be compared to placebo L’albumina umana grazie alle sue proprietà emoreologiche ha dato numerosi dati positivi in vari studi preclinici di neuroprotezione ischemica. I Ricercatori dello studio pilota ALIAS ( ALbumin in Acute Stroke ) hanno esaminato la sicurezza e la tollerabilità di questa terapia nei pazienti con ictus ischemico acuto. I soggetti con ictus ischemico acuto ( punteggio alla scala NIHSS di 6 o superiore ) hanno ricevuto un’infusione di 2 ore di Albumina umana 25%, iniziando entro 16 ore dall’insorgenza dell’ictus, e successivamente è stato loro somministrata Albumina a dosaggi compresi nel range 0.34 e 2.05g/kg di peso corporeo. A 3 mesi, i pazienti sono stati sottoposti a valutazione mediante la scala NIHSS ( NIH Stroke Scale ), la scala Rankin modificata, ed il Barthel Index. Un totale di 82 soggetti ( età media 65 anni ) hanno ricevuto Albumina, mediamente, 7.8 ore dopo l’insorgenza dell’ictus; 42 pazienti hanno anche ricevuto un dosaggio standard di tPA ( tissue Plasminogen Activator ). L’aumento dose-correlato dell’albumina plasmatica ed una lieve emodiluizione hanno avuto un picco massimo tra la 4.a e la 12.a ora. I livelli plasmatici del peptide natriuretico cerebrale ( BNP ), età-correlati, sono aumentati a 24 ore dopo la somministrazione di Albumina, ma non hanno predetto eventi cardiaci avversi. Il solo evento avverso correlato all’Albumina era edema polmonare lieve-moderato nel 13.4% dei pazienti, controllato con diuretici. Nel sottogruppo dei pazienti trattati con tPA, l’emorragia intracranica sintomatica si è presentata solamente in 1 dei 42 soggetti. L’Albumina umana 25% in dosaggi fino a 2.05g/kg è risultata tollerata nei pazienti con ictus ischemico acuto senza complicanze maggiori dose-limitanti. La terapia con tPA non ha influenzato il profilo di sicurezza dell’Albumina.

Recenti studi clinici per la neuroprotezione ischemica III – Magnesio Recettore NMDA Magnesium Sulphate NMDA antagonist Ca2+ channel antagonist Clinical trials on Magnesium in acute stroke therapy IMAGES- No benefit Lancet. 2004 Feb 7;363(9407):439-45. Magnesium for acute stroke (Intravenous Magnesium Efficacy in Stroke trial): randomised controlled trial Magnesium is neuroprotective in animal models of stroke, and findings of pilot trials suggest potential benefit in people. 2589 patients were randomised within 12h of acute stroke to receive 16 mmol MgSO4 intravenously over 15 min and then 65 mmol over 24 h, or matching placebo. FINDINGS: outcome was not improved by magnesium. Field Administration of Stroke Therapy - Magnesium (FAST-MAG) Trial - Recruiting Magnesium Sulfate Therapy for Acute Stroke Initiated Within 2 Hours of Onset by Paramedics in the Field This trial will also demonstrate that paramedics can safely, effectively, and rapidly start neuroprotective therapies for stroke. Numerosi studi sperimentali nell’animale hanno dimostrato che il Mg è capace di ridurre il danno ischemico cerebrale. I meccanismi, sembrano si possano ricondurre ad un potenziamento del blocco del recettore NMDA. Sebbene un primo trial clinico non abbia dimostrato l’efficcacia del Mg nel ridurre il danno ischemico cerebrale nell’uomo, con l’esclusione degli infarti lacunari dove avrebbe determinato una lieve riduzione del danno, una nuova sperimentazione è in corso. Questa è volta a dimostrare l’efficacia del Mg nella terapia dello stroke quando somministrato entro le prime 2 h da personale paramedico.

Recenti studi clinici per la neuroprotezione ischemica IV – Statine (in corso) STATINS 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase inhibitors Pleiotypic effects in addition to cholesterol lowering properties Reduce ishemic volumes in several preclinical experimental models Figure 1.  The pleiotropic effects of statins in stroke A schematic of the cholesterol biosynthesis pathway showing the effects of inhibition of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase by statins. Decreased isoprenylation of signaling molecules leads to modulation of various signaling pathways. 1- In high-risk populations, statin therapy is known to reduce the risk of stroke. 2- A meta-analysis of 10 trials involving 79,494 subjects shows that statin therapy reduces the incidence of stroke by 18%, 3- Benefit can be achieved even when treatment is initiated after the onset of symptoms. 4- A retrospective analysis shows that patients using lipid-lowering agents (mainly statins) have a reduced mortality rates. 5- Retrospective analysis shows that poststroke statin use predicts good functional outcome. 6-A small trial (Markers of Inflammation after Simvastatin in Ischemic Cortical Stroke) shows significant improvement in patients treated with simvastatin 3 to 12 hours after stroke onset. Based on these preliminary data, clinical trials of statin therapy in acute stroke have been initiated. La statine, inibitori della sintesi del colesterolo, hanno dimostrato proprietà neuroprotettive dirette. Si pensa che queste debbano ricondursi alla ridotta isoprenilazione con conseguente aumento di attività della eNOS, della vasculogenesi e riduzione dello stress ossidativo. Sono oramai numerose le evidenze che le statine riducono il rischio di eventi cardiovascolari e cerebrali. Una metaanalisi dimostra che le statine riducono l’incidenza del danno ischemico cerebrale del 18% e riducono la mortalità da stroke nonché il recupero funzionale anche quando soimministrate dopo l’insorgenza dell’ischemia cerebrale. Vari clinical trials sono stati iniziati al fine di valutare l’efficacia delle statine nella terapia dello stroke acuto.

La minociclina: una tetraciclina neuroprotettiva Possibili meccanismi neuroprotettivi Antiossidante Antinfiammatoria Inibisce le metalloproteinasi Promuove l’espressione di Bcl-2 Inibisce la poli (ADP-ribosio) polimerasi La diapositiva dimostra come in vari studi clinici con statine, l’incidenza dello stroke sia significativamente ridotta.

effetto di alcune statine sul danno ischemico cerebrale Minociclina: un recente studio clinico positivo effetto di alcune statine sul danno ischemico cerebrale La diapositiva dimostra come in vari studi clinici con statine, l’incidenza dello stroke sia significativamente ridotta.

III Revisione critica La diapositiva dimostra come in vari studi clinici con statine, l’incidenza dello stroke sia significativamente ridotta.

Perche tanti fallimenti? Timing: somministrazione del farmaco fuori dalla finestra terapeutica Età e malattie associate Differenze morfologico-funzionale tra animale da laboratorio e uomo Effetti collaterali: non valutati nell’animale Parametri di valutaziuone dell’efficacia: precoce nell’animale, tardiva e funzionale nell’uomo Differenze tra concentrazioni ematiche nell’animale e nell’uomo Mancata selezione dei pazienti. Valutazione del mismatch perfusione-dffusione Il netto contrasto tra i numerosi studi preclinici positivi e la sostanziale inefficacia degli stessi composti nell’uomo pone la domanda del perchè esista tale discordanza. In diapositiva vengono elencate quelle che al momento sembrano le principali ragioni del fallimento dei composti neurprotettivi nell animale quando impiegati nelluomo.

Trattamento dello stroke acuto: una rivalutazione Nessun tipo di neuroprotettore ha mostrato un’efficacia maggiore degli altri: questo indica che i meccanismi responsabili della neurodegenerazione ischemica hanno una analoga rilevanza patogenetica suggerisce l’importanza di un approccio terapeutico multiplo/combinatoriale Come evidenziato da questo lavoro del 2006, dei 1026 composti studiati come possibili neuroprotettori ischemici nell’animale, “solo” 114 sono stati provati nell’uomo. E’ da rilevare che questi ultimi non avevano mostrato un’ efficacia neuroprotettiva maggiore di quelli non testati in clinical trials. Inoltre, tra le varie classi di composti, non esistono differenze significative per quanto riguarda il grado di neuroprotezione ischemica. Questo suggerisce che nessun meccanismo gioca un ruolo patogenetico più rilevante degli altri e che quindi debbano essere intraprese terapie combinate con più classi di farmaci.

Il concetto di “unita neurovascolare” dalla neuroprotezione alla protezione neurovascolare control ischemia Nell’ambito della protezione ischemica, un concetto fisiopatologico/neuroanatomico che sta assumendo sempre maggior attenzione è quello della “neurovascular Unit”. L’attenzione si è spostata quindi dal neurone come solo bersaglio di farmaci neuroprotettori antiischemici al complesso neuroni-glia-endoteli-membrana basale come complesso funzionale che deve mantenere la sua integrità per poter raggiungere un grado di neuroprotezione significativo e duraturo. I processi che sono scatenati dall’insulto ischemico cerebrale e che contribuiscono alla distruzione della neurovascular unit sono evidenziati in figura. Nel complesso oggigiorno non si parla più di neuroprotezione ma di protezione neurovascolare.

IV Prospettive Future La diapositiva dimostra come in vari studi clinici con statine, l’incidenza dello stroke sia significativamente ridotta.

Indicazioni per il preclinico e il clinico Uso di modelli sperimentali in animali girencefalici Sviluppo di nuove strategie terapeutiche e nuovi bersagli farmacologici implicati in più di un evento citotossico della “cascata ischemica”: PARP, minocycline, HMGB1, HDAC, gene expression etc………… Approccio terapeutico combinatoriale: vari farmaci neuroprotettivi per colpire contemporaneamente vari eventi neurodegenerativi Nonostante i numerosi tentativi di sviluppare un farmaco neruoprotettore nell’ischemia cerebrale, i dati clinici dimostrano che ancora nessuna molecola sia in grado di ridurre la neurodegenerazione ischemica attraverso un’azione diretta sul parenchima cerebrale. Numerose sono state le ragioni avanzate per spiegare il fallimento clinico di farmaci che a livello preclinico sono attivi nel ridurre i volumi infartuali da stroke acuto. Tra le varie ragioni elencate in figura, si ritiene unanimamente che debba essere rivista l’idea di studiare un singolo farmaco neuroprotettore per volta, e che debbano essere iniziati studi clinici con più potenziali neuroprotettori associati.

Terapia neuroprotettiva combinata anti-stroke Razionale: - Colpire i vari meccanismi patogenetici - Associare neuroprotezione a rivascolarizzazione - Ridurre gli effetti indesiderati - Estendere la finestra terapeutica Esempi preclinici di terapia combinata: Nimodipine + Mannitol + Dexamethasone + Barbiturates (36% protezione) Tirilazard + Mg2+ + Hypothermia (73% protezione) Esempi clinici di terapia combinata tPA + clomethiazole (GABA agonist) tPA + Lubeluzole (Glutamate antagonist) tPA + NXY-059 Mg2+, atorvastatin, minocycline, albumin, hypothermia (ongoing, Ashfaq Shuaib,University of Alberta, Edmonton) Nessun vantaggio rispetto al solo tPA In diapositiva vengono elencate le ragioni della terapia combinata per lo stroke e alcuni dati prcleclinici e clinici sull’efficacia della stessa.

Adequate dose-response studies and serum concentrations measured to defined minimally and maximally effective doses Time-window studies to confirm efficacy Physiological monitoring should be undertaken Combined pharmacological approaches are needed Randomized, blinded studies that give reproducible effects Infarct volume measured and functional tests used, including short-term and long-term assessment Small rodent studied with permanent MCAO; if only model used is transient MCAO, then reperfusion should be targeted in clinic Larger species used for novel, first-in-class compounds Studies published in peer-reviewed journals

CONCLUSIONI Un approccio farmacologico corretto per il successo della “Neuroprotezione Ischemica” - Politerapico - Farmaci con effetti neuroprotettivi pleiotipici sull’unità neurovascolare - Con tempistica adeguata - Su pazienti selezionati mismatch DWI/PWI severità tipo di ictus In diapositiva vengono elencate le ragioni della terapia combinata per lo stroke e alcuni dati prcleclinici e clinici sull’efficacia della stessa. - Contemporaneo alla rivascolarizzazione