Metodi enzimatici in diagnostica clinica

Enzymatic reaction-based assays Vantaggi -veloce -molto specifico Metodi di - Misura in continuo (più facili e più utili) - Misura a tempo fisso Influenze - pH - temperatura -forza ionica

Michaelis-Menten enzyme kinetics Km

Spesso non è possibile un singolo enzima-reazione sequenziale Eprim Eind A B C X Y t ~ 0 [B] << KmB, vind = Vind.[B]/KmB - 1st order reaction t > 0 k.[Eprim] = Vind vind = Vind.[B]/(KmB + [B]) = Vind/(KmB/[B] + 1) [B]  100.KmB - error 1% It is necessary to use 10 to 100-fold excess of Eind over Eprim!!!

NAD(P)H assay - Wartburg optical test A + NADH + H+ B + NAD+ H H H Tutte le deidrogenasi NAD o NADP dipendenti utilizzano queso metodo

Test ottico accoppiato A + B C + D C (oD) +NADH E + NAD+ E’ possibile accoppiare una terza reazione

Calcolo attività enzimatica 1 UI =1 micromole di substrato trasformato/min = c / min Attività enziamtica (mUI / ml) = DA V 1000 min e v d DA = variazione assorbimento a 340 1000 = fattore di conversione alle mUI V = volume totale della miscela di reazione e = coeff. Estinzione molare di 1 mmole/ml di NADH a 340 6.22 cm2/mmole v = volume del campione (ml) d = cammino ottico (1cm)

esempi NH4+ CO2

NO3- H2 O2 SO32-

Ethanol, Acetaldehyde Acetate

Ascorbate 578 nm

Citrate Malate Fumarate Oxalate, Formiate

Succinate

Lactate Pyruvate 2-Oxoglutarate L-Glutamate L-Glutamine

Glucose Sucrose Fructose

Glycerol Triacylglycerols Free fatty acids 546 nm

Cholesterol 405 nm Bile acids 576 nm Urea

AMP/ADP ATP

NAD(P)H - bioluminescence (493 nm) Metodi in luminescenza ATP - bioluminescence h. (562 nm)

Diagnostica nell’ischemia cardiaca Transaminasi glutamico ossalacetica (GOT) GOT aumenta dopo 6 ore l’infarto max a 36 ore livelli normali 5gg

Creatina chinasi Creatina fosfato Fosfocreatina + ADP creatina + ATP Creatina chinasi Aumenta dopo 3 ore dall’infarto max 24-30 h livelli normali 3gg

Lattico deidrogenasi Aumento entro 2 ore max 60 ore ritorno alla norma lento Troponine cardiache: molto specifiche per il cuore

Dosaggio del substrato 10 ml di NADH 20 mM (Ci) vengono messi in 2 ml di soluzione tampone (CfNADH = 100 µM) 10 ml di piruvato prelevati dal liquido biologico (siero) 10 ml di lattico deidrogenasi Piruvato + NADH + H+ lattato + NAD+ Sapendo che l’e molare di NADH è 6,22 mM-1 cm-1 0,1 mM di NADH avrà un assorbanza di 0,622 (Ai) Nella lettura Af ottengo: 0,322 DA = elDC DA = 0,622 – 0,322 = 0.3 DC = DA/el = 0.3 / 6,22 mM-1 cm-1 x cm = 0,48 mM = 48 mM Le micromoli di piruvato nei 2 ml della cuvetta saranno uguali a 48 mM x 2 ml / 1000 = 0, 096 mmoli [piruvato] = 0,096 / 10 ml (volume usato) = 9,6 mM (concentrazione del piruvato)