Facoltà di Farmacia Corso di laurea in Chimica e Tecnologia Farmaceutiche Insegnamento di Microbiologia e Biologia animale

PREPARAZIONE DEL MATERIALE PER L’ESAME BATTERIOSCOPICO L’esame batterioscopico a fresco ci consente di identificare il tipo di germe batterico,spesso comunque le caratteristiche microscopiche non sono sufficienti alla diagnosi e si ricorre quindi ad altre tecniche per avere la possibilità di formulare la diagnosi: tuttavia spesso l’esame batterioscopico fornisce una indicativa diagnosi, pur grossolana, cioè una panoramica della popolazione microbica presente. L’esame batterioscopico si può effettuare oltre che a fresco mediante colorazione, in genere per prelevare piccole quantità potenzialmente infette si ricorre all’ansa metallica che viene sterilizzata per calore con la fiamma del becco bunsen, sino all’incandescenza. L’ansa metallica comunemente usata in batteriologia è un filamento di nichel cromo innestato su un supporto metallico che termina con un rivestimento isolante, se l’estremità del filo è chiusa ad anello si chiama ansa ad anello se non è chiusa si chiama ansa a filo. Di solito si usa l’ansa a filo.

PREPARAZIONE DEL MATERIALE Il materiale prelevato con l’ansa viene depositato su di un vetrino porta oggetto che si copre con un vetrino copri oggetto. Si può sterilizzare sia l’ansa che il vetrino con il becco bunsen, la sterilità è raggiunta quando l’ansa diventa rosso incandescente, allontanandola dalla fiamma si attende un po’ per farla raffreddare, la quantità di materiale presa con l’ansa viene poi distesa sul vetrino portaoggetti. La sterilizzazione del vetrino dopo la deposizione del materiale da osservare si chiama fissazione mediante flambaggio, questa operazione è preceduta dall’asciugamento del materiale. La fissazione del materiale disteso può avvenire anche con sostanze chimiche ad esempio ponendo il preparato per alcuni minuti in alcool metilico. Si ricorre comunemente a rendere il materiale da osservare liquido mediante sospensione in acqua o altro liquido, nell’anello dell’ansa si forma un film liquido, contenente il materiale, Si può usare un altro strumento invece dell’ansa, la pipetta pasteur sterile, viene comunque flambata. La cellula di Kock serve per effettuare l’esame a goccia pendente, è costituita da un vetrino più spesso del portaoggetti normale che presenta al centro una concavità: il materiale viene depositato su un copri oggetto poi questo viene appoggiato sulla concavità previa deposizione di paraffina sugli angoli, il tutto viene ribaltato permettendo un ‘osservazione del materiale in cui sono presenti i batteri liberi di muoversi senza ulteriori modifiche.

Osservazione e colorazione Esame in campo scuro: e’ possibile effettuare anche una osservazione con inchiostro di china per cui tutte le strutture batteriche appariranno incolori in un campo buio. La differenziazione cromatica ci consente di effettuare un differenziazione diagnostica, uno dei metodi è quello di usare colori vitali che consentono l’osservazione dei batteri in campo chiaro che comunque non risentono della presenza del colore. Si può effettuare un esame batterioscopico previa colorazione, il preparato viene sottoposto alle fasi di asciugamento e fissazione e poi la colorazione. L’asciugamento permette l’allontanamento della parte liquida, si può effettuare sia tramite la fiamma del becco bunsen che impiegando un termostato, per la fissazione può essere impiegatolo stesso calore della fiamma ma anche disidratanti chimici come : etanolo, cloroformio, L’uso del bunsen può comportare problemi di carbonizzazione ma contribuisce a mantenere sterile l’ambiente nel quale operiamo. La fissazione alla fiamma dura 15 20 secondi, si procede quindi con la colorazione, considerato l’ambiente cellulare batterico acido (radicali acidi) vengono usati coloranti basici. Il colore è in realtà un sale che disciolto in alcool verrà dissociato poi in soluzione acquosa, con soluzione finale idroalcolica, la parte della molecola che porta il gruppo cromoforo sarà in grado di legare le strutture acide del batterio (carica negativamente e quindi basica). Si utilizzano pochi coloranti Blu di metilene, fucsina, violetto di genziana. Si possono impiegare anche i mordenti come il liquido di Lugol, che permette la formazione di un composto insolubile che garantisce un migliore legame con le strutture batteriche.

Colorazione di Gram

Col. di Gram

Colorazione di gram

Zhiel Neelsen

Zhiel Neelsen