Espressione proteine (farmaci) ricombinanti • studiare i rapporti struttura/funzione • produrre enzimi a scopo industriale • conferire a piante o animali nuove proprietà • per PRODURRE FARMACI-RICOMBINANTI (PROTEINE)

Pc= promotore costitutivo Lac I= gene regolatore Induttore (lattosio o IPTG) Si lega all’operatore Pc lacI Pi O Z Y A mRNA policistronico Pc= promotore costitutivo Lac I= gene regolatore -previene la trascrizione -riconosce e lega la piccola molecola di induttore. Pi= promotore inducibile O=operatore Z,Y,A= geni strutturali (galattosidasi, permeasi, transacetilasi)

Al sistema descritto si associa inoltre un sistema definito di repressione da glucosio. In presenza di abbondanti quantità di glucosio e lattosio E.coli metabolizza esclusivamente glucosio, ma quando il livello di glucosio si abbassa vi è una risposta metabolica complessa che prevede l'attivazione dell'adenilato ciclasi (sensore di bassi livelli di glucosio) e conseguente aumento di cAMP. cAMP si lega ad una proteina (CRP) cAMP receptor protein. Il complesso cAMP-CRP lega con alta affinità una sequenza di DNA a -68 -55 e il complesso con il DNA in questo punto facilita l'aggancio dell'RNA polimerasi che forma un legame più stabile con il promotore

Vettore di espressione gene lac I, gene lac Z’ (solo la porzione N-terminale di b-galattosidasi) che può essere indotto da IPTG polilinker a valle del promotore lac e dopo poche basi di lac Z’ La sola porzione N-ter di b-galattosidasi non è funzionante, così come la sola porzione C-term. Ma se le uniamo e induciamo l’espressione, la proteina che si ottiene diventa funzionante (peptide di b-galattosidasi funzionante). Anche mutazioni nel gene lac Z dei batteri daranno origine a una b-galattosidasi non funzionante. Se in questo batterio introduciamo un plasmide che esprime il peptide lac Z’, questo potrà produrre b-galattosidasi e complementare il batterio senza galattosidasi funzionante (complementazione). Mettendo un substarto cromogeno (X-gal) in grado di essere idrolizzato dalla galattosidasi, si potrà verificare praticamente l’azione delle galattosidasi ottenuta mediante complementazione.

TAG lacI oriC Ap ori Promotore/operatore Terminatore Shine-Dalgarno MCS Promotore/operatore Terminatore Shine-Dalgarno lacI oriC TAG

SISTEMA pET Il promotore lac non è molto forte. Per produrre proteine ricombinanti si preferisce usare altri vettrori ingegnerizzati, come il vettore pET, basati sull’operone lac. Questo vettore utilizza il promotore della T7 RNA polimerasi di fago, invece del promotore lac. Questo promotore è molto più forte del promotore lac e riconosce in modo specifico solo la T7 RNA pol. Il sistema pET richiede che anche l’ospite batterico sia geneticamente ingegnerizzato (E.coli BL (DE3). Questo ceppo ha integrato nel suo cromosoma il gene della T7 RNA polimerasi di fago. La T7 RNA pol nel genoma dell’ospite è costruito in maniera tale che sia sotto il controllo del promotore e operone lac. Pertanto, l’induzione con IPTG provoca la sintesi di T7 RNA pol, che va a legarsi al suo promotore nel plasmide di espressione dando luogo alla sintesi della proteina

Il prodotto proteico ottenuto dalla trascrizione di un cDNA inserito in un vettore di espressione si può ottenere in procarioti: come aggregato proteico insolubile (corpi inclusi ) come proteina fusa, come proteina nativa integra.

Purificazione Le proteine possono essere separate secondio la carica, l’idrofobicità, l’affinità per alcune molecole, ecc. I sistemi cromatografici attualmente disponibili sono diversi. Il sistema cromatografico più utilizzato per separare le proteine ricombinanti è la cromatografia per affinità.

5’ -CATCATCATCATCATCAT- 3’ 3’ -GTAGTAGTAGTAGTAGTA- 5’ -His- His- His- His- His- His- N Ni 2+ O - Expressed protein with N- or C-terminal His tag Ni-NTA matrix NH2-H-H-H-H-H-H-D-D-D-D-K-XXXXXXXX NH2-XXXXXXXXXXXX Proteina senza extra sequenza

Espressione in cellule eucariotiche (cenni) La cellula eucariotica è l’ambiente naturale per esprimere proteine eucariotiche. Sono disponibili oggi una grande varietà di sistemi di espressione eucariotici. Questi sistemi si basano sulla capacità di fare esprimere in cellule eucariotiche in coltura una proteina codificata da un gene clonato nell’opportuno vettore di espressione. Il sistema di base non è diverso da quello utilizzato per esprimere le proteine nei batteri o nel lievito. Tuttavia sono richiesti requisiti particolari propri degli eucarioti Il primo problema è quello di introdurre il DNA ricombinante nelle cellula eucariotica ospite.

Virus del vaiolo del vaccino Virus del vaiolo del vaccino o virus vaccino (Vaccinia virus). Questo virus ha un genoma di soli 184 kb e può ospitare inserti abbastanza grandi. Si replica nel citosol della cellula ospite senza entrare nel nucleo ed ha la capacità di infettare un largo spettro di cellule. Una caratteristica importante di questo virus è la codificazione di una propria RNA polimerasi e di enzimi propri che provvedono ad aggiungere il cap e la coda di poli-A. Ha un’altissma efficienza di infezione (circa 100%) al punto che la sintesi proteica della cellula ospite viene ridotta quasi a zero. Metodo: la cellula viene infettata con 2 ceppi ricombinanti. Un ceppo porta il gene della T7 RNA polimerasi sotto il controllo di un promotore tardivo del virus P7.5, l’altro ceppo porta il gene che vogliamo fare esprimere sotto il controllo della T7 RNA polimerasi. Le cellule infettate con il primo ceppo in poco tempo (3 ore) producono notevoli quantità di T7 RNA polimerasi, che va a legarsi al suo promotore nel ceppo 2, dando luogo alla produzione di notevoli quantità di proteina. La proteina si acculula per 24-48 ore e può essere facilmente identificata disponendo dell’anticopro opportuno

Ceppo 2 Ceppo 1 Proteina esogena P7.5 Gene T7 coninfezione Pgene 10T7 gene esog coninfezione RNA polimerasi Proteina esogena

Characteristics E. coli Yeast Insect cells Mammalian cells Cell growth rapid (30 min) rapid (90 min) slow (18-24 h) slow (24 h) Complexity of growth medium minimum complex Cost of growth medium low high Expression level low - high low - moderate Extracellular expression secretion to periplasm secretion to medium Posttranslational modifications Protein folding refolding usually required refolding may be required proper folding N-linked glycosylation none high mannose simple, no sialic acid O-linked glycosylation no yes Phosphorylation Acetylation Acylation gamma-Carboxylation

A prescindere del sistema di espressione… Stadi del processo Isolamento del gene di interesse Introduzione nel vettore di espressione Transformazione nelle cellule ospiti Crescita delle cellule in un fermentatore Isolamento e purificazione della proteina Formulazione del prodotto proteico

Vantaggi Caratteristiche dei farmaci prodotti con la tecnologia del DNA ricombinante: Sicurezza Perfettamente uguale a quella naturale Grandi quantità

Coltura cellulare piccola scala (1 Liter) L’espressione si fa avvenire in colture cellulari da 1-2 litri

Coltura batterica e incubatore (pilota)

E. coli come produttore di proteine terapeutiche Genetica batterica bene caratterizzata Alti livelli di espressione Cells grow rapidly on simple and inexpensive media, fermentation technology well established Table 3.10 from Biopharmaceuticals, Ed. G. Walsh 1998

Test Test chimici e biologici: Misura dell’attività della proteina ricombinante Conferma che è identica a quella naturale umana Test sugli animali per essere sicuri che non è tossica ed è efficace

Coltura su larga scala:produzione industriale (fino a 12,000 Litri) Dopo che la proteina è stata testata essere sicura e funzionante, si passa alla produzione su grandi quantità Le cellule ospiti sono cresciute in grandi fermentatori Le condizioni di crescita sono ottimizzate per dare grandi quantità di proteina a costi bassi

Recupero del prodotto,, Formulazione, Controllo di qualità Un passaggio cruciale è la purificazione affinchè mantenga la sua funzionalità e possa essere sottoposta a rigorosi standard clinici di qualità Importanti sono anche le condizioni di conservazione affinchè mantenga la sua efficacia biologica.

Ultima tappa: Nuovo prodotto nel mercato

Insulina ricombinante Ripercorriamo la storia dell’insulina…… 1921: Dr. Frederick Banting and Charles Best isolate insulin and use it to treat diabetic dogs. 1922: At the age of 14, Leonard Thompson becomes the first human being to receive insulin. 1923: Eli Lilly and Company markets Iletin® (animal source insulin), the first commercially available insulin. Insulina ricombinante 1950s: Amino acid sequences for several species of insulin are described. 1960s: Complete chemical synthesis of insulin is achieved. Proinsulin is discovered. Purity of insulin is improved. X-ray crystal structure of insulin is established. 1980 Insulina ricombinante perfettamente uguale a quella naurale

Prime preparazioni in ambiente acido instabili deaminazione N A21 Perdita di efficacia Formulazioni neutre: aggiunta di Zn Strutture esameriche Picco attività 2-3 ore (durata max 6-8 ore) Ritardo di azione (dissociazione dell’esamero nei costituenti dimeri e/o monomeri) Progettazione di analoghi monomerici per una risposta più naturale all’aumento post-prandiale della glicemia Modificazione delle proprietà autoassociative dell’insulina per favorire le specie monomere e minimizzare il ritardo dell’azione

Analoghi insulina A-catena Humaninsulin B-catena Insulina LysB28PROB29 V N I T L Q S E H2N COOH 10 20 A-catena H P A F R K 30 B-catena Insulina LysB28PROB29 Insulin lispro G C V N I T Q S E Y L H2N COOH 10 20 P A F R K H 30 Inversione di due aminoacidi nella porsione C-terminale della catena B Provocano una ridotta tendenza ad autoassociarsi rispetto all’insulina naturale L’insulina LISPRO inizia ad agire dopo 15 minuti e raggiunge il picco dopo 1 ora

Insulin glargine (Lantus; Aventus Pharma) : inserimento di due arginine all’espremità C terminale della catena B (B31, B32) e sostituzione della glicina A21 Auemnto del punto isoelettrico; precipitazione dell’insulina nel sito di iniezione e assorbimento protratto nel tempo. . Insulin glargine G C V N I T Q S E Y L H2N COOH 10 20 K A F R P H 30 Insulin aspart G C V N I T Q S E Y L H2N COOH 10 20 K A F R D H 30

VACCINI

Fare produrre il farmaco dal latte di animale Alcune proteine sono prodotte mediante animali Transgenici. Un organismo transgenico contiene nel suo patrimonio genetico un gene estraneo alla sua specie. Idea: Fare produrre il farmaco dal latte di animale

ANIMALI TRANSGENICI Per animali transgenici si intendono quegli animali ottenuti attraverso una manipolazione del genoma, inserendo uno o più geni, appartenenti alla stessa specie, o più spesso ad altre specie.

1- MICROINIEZIONE NEI PRONUCLEI Induzione di superovulazione nelle femmine Accoppiamento Raccolta oociti fecondati Iniezione con micropipetta del DNA esogeno (DNA di interesse) nel pronucleo maschile dei singoli oociti Reimpianto degli oociti che sopravvivono negli ovidotti di altre femmine e lasciati sviluppare fini al termine della gravidanza Eventi: Integrazione a caso del DNA iniettato nel DNA cromosmico (evento unico) I siti di integrazione contengono copie multiple del transgene integrato (concatameri testa-coda) Trasmissione alla progenie con modalità mendeliane ( se è integrato nello zigote, verrà trasmesso al 50% della progenie) Controllo per PCR la presenza del DNA esogeno

I cloni di DNA introdotti vanno a integrarsi in corrispondenza di incisure nel DNA cromosomico, formando dei transgeni

IMPIEGO DELLE CELLULE STAMINALI IN COLTURA Le cellule ES sono cellule embrionali totipotenti, infatti possono dare origine a cellule di tessuti differenti. Le cellule ES vengono prelevate dalla massa cellulare interna della blastocisti(cellula embrionale indifferenziata) e mantenute in coltura in presenza di cellule o fattori che ne impediscono il differenziamento. In queste condizioni le cellule ES mantengono intatta la loro capacità di differenziarsi in modo appropriato in qualunque tessuto, una volta reintrodotte in un embrione

TAPPE del PROCESSO: Le cellule staminali che hanno integrato nel loro genoma il DNA ricombinato, vengono iniettate in un embrione isolato in stadio precoce di sviluppo. L’embrione precoce, composto parzialmente da cellule ES, viene introdotto nell’utero di una femmina pseudogravida. Il topo “chimera” che si sviluppa da questo embrione conterrà alcune cellule somatiche portatrici del gene alterato e conterrà anche cellule della linea germinale che portano il gene modificato. Il topo “chimera” verrà incrociato con un topo normale e alcuni discendenti (2 su dieci) avranno un gene modificato in tutte le loro cellule ( eterozigosi). Incrociando tra loro questi topi portatori del gene modificato si ottiene qualcuno dei discendenti contenente 2 geni alterati in tutte le sue cellule (omozigosi ). Se l’alterazione genica originale inattiva completamente la funzione genica si avranno allora dei topi ad “eliminazione” (Knock-out) cioè ceppi di topi che hanno un certo gene inattivato definitivamente

Isolamento della blastocisti TECNICA: IMPIEGO DELLE CELLULE STAMINALI IN COLTURA Isolamento della blastocisti Coltivazione all’esterno delle cellule interne (ES) Modificazione delle cellule mediante inserimento di DNA esogeno Reinserimento delle cellule modificate nella blastocisti di un altro ceppo Reimpianto in una madre adottiva Gravidanza: Chimera: due popolazioni di cellule Il reincrocio delle chimere può produrre topi eterozigoti per la modificazione genetica Il successivo incrocio di mutanti eterozigoti può produrre omozigoti

Proteine farmacologiche prodotte con animali transgenici

Recuperare la proteina dalle urine Idea meno estetica, ma altrettanto efficace Utilizzare cellule di vescica animale per produrre proteine Recuperare la proteina dalle urine

Anticorpi Lo sviluppo delle conoscenze sugli anticorpi derivanti dalla biologia molecolare ha dato un notevole impulso alla produzione di anticorpi ingegnerizzati mediante la tecnologie del DNA ricombinante. In particolare è stato possibile realizzare anticorpi chimerici in cui le proprietà utili di legame dell’antigene di una molecola anticorpale di una specie vengono inserite geneticamente sulle regioni costanti degli anticorpi di una specie differente.

Fattori di crescita Descrizione G-CFS GM-CFS Endogeni Cromosoma 17 5 Aminoacidi 174 (177) 127 Glicosilazione O-glicosilazione N- O-glicosilazione PM 18,6 (20) 1.7 Ricombinanti Nome Filgrastrim Lenograstim Nartograstim Molgramostim Sargramostim Aa 175 (N-Met) 174 174 128 127 (23) Glicosil. NO O-glicosil No No N-glicosil. Sistema Espressione E.coli Ov. cric E. coli E.coli lievito

Epo Descrizione EPO (eritropoietina) Endogena Cromosoma 7 Aminoacidi 165 (2 ponti disolfuro, 3 catene legate all’N e 1 legata a O) Glicosilazione O-glicosilazione (proteina attiva solo se glicosilata) Ricombinanti Nome Epoietin alfa Epoietinum alfa Sistema Espressione ovaio di criceto

Interferoni Interferoni, dotati di attività antivirale e antitumorale. Scoperti nel 1957, sono proteine prodotte dalla maggior parte delle cellule di tutti i vertebrati quando adeguatamente stimolate, ed hanno un'azione specie specifica La quantità prodotta nell'organismo umano in condizioni normali è così bassa da rendere impensabile ottenerli per estrazione per qualsiasi applicazione pratica in campo terapeutico. A partire dai primi anni'80 invece, i geni sono stati clonati ed è stato possibile la produzione di queste proteine su larga scala. In terapia si sfruttano in particolare le loro attività antivirale e antitumorale. Nel trattamento dei tumori, gli interferoni sembrano arrestare la proliferazione delle cellule cancerogene, e in molti casi si osserva una riduzione della massa tumorale. Come antivirale, gli interferoni sono impiegati nella terapia dell'epatite B e C.

Fattori di coagulazione Alcuni dei fattori coivolti nel complesso prcesso di coagulazione sono oggi prodotti su larga scala facendoli espimere in un sistema eterologo, soprattutto eucariotico. I geni dei fattori VIII e IX sono stati clonati ed espressi in cellule di mammifero. Alcune di queste proteine si possono anche modificare. A questo proposito, un esempio è cosituito dall’ attivatore tissutale del plasmimogeno(tPA), un fattore trombolitico. Il gene è stato clonato ed espresso in cellule di mammifero mediante l’amplificazione genica in cellule trattate con metotrexato. Spesso la molecola è taglitata a dare una forma in due catene. Si cerca di capire la funzione dei vari domini in modo tale da produrre proteine mirate e più efficaci. Per esempio il prodotto, noto come Rapylisin, manca del dominio finger, di un kringle e dell’EGF.

Rapilysin® (Reteplase) SERIN PROTEASE 1 NH2 355 COOH Rapilysin® (Reteplase) FINGER EGF SERIN PROTEASE 1 NH2 527 COOH Si tratta di una proteina di 522 amino acidi con 17 ponti disolfuro, in cui si possono individuare diverse regioni: un dominio finger all’N-ter, un dominio epidermal growth factor (EGF) due strutture ad anello, dette kringle, un dominio serina proteasico all’estremità C-ter (figura 163).