Identificazione di geni nei mammiferi by N.A.

Studiare un genoma Studiare un genoma significa : clonare le sue sequenze, ordinare i cloni per ricomporre l’organizzazione spaziale delle sequenze comprendere l’architettura del genoma identificando i diversi tipi di DNA e la loro distribuzione identificare i geni e la loro funzione studiarne l’evoluzione attraverso il confronto con altri genomi by N.A.

Dalla genetica alla genomica: timeline di una “evoluzione concettuale” by N.A.

1865 - 1944 Da Mendel al DNA by N.A.

1866: le leggi di Mendel Per la prima volta è indagato scientificamente il problema della trasmissione dei caratteri: Mendel scopre le leggi dell’ereditarietà. Mendel, G. “Versuche über Pflanzen-Hybriden” in “Verhandlungen des naturforschenden Vereines, Abhandlungen Brünn “, 4, 3-47, (1866). Gli individui possono essere selezionati e incrociati scientificamente, ma non c’è ancora una spiegazione molecolare del fenomeno... by N.A.

La biochimica 1869: Miescher per la prima volta isola una sostanza che chiama nucleina perchè abbondante nel nucleo cellulare e scrive l’articolo “La composizione chimica delle cellule del pus”. Più tardi la nucleina, caratterizzata chimicamente, si dimostrerà un acido, le cui componenti sono desossiribosio, fosfati e basi azotate. La sostanza è ribattezzata DNA. Miescher, F. "Ueber die chemische Zusammensetzung der Eiterzellen”, Hoppe-Seyler's medicinisch-chemische Untersuchungen, 4, 441-460, (1871). by N.A.

La citologia 1903: Sutton propone la teoria cromosomica dell’ereditarietà, correlando il comportamento in meiosi dei cromosomi scoperti da Flemming nel 1882 con le modalità di trasmissione dei caratteri mendeliani. La teoria sarà dimostrata da Morgan nel 1910 con studi in Drosophila. Sutton, W. “The chromosomes in heredity”, Biological Bulletin, 4, 231-251, (1903). by N.A.

Il principio trasformante : il DNA Avery, O.T., MacLeod, C.M. and McCarty, M. “Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types”, J. Exp. Med., 79, 137-158, (1944). 1944: Avery, McCarty e MacLeod identificano nel DNA la molecola della informazione ereditaria: costituisce il “principio trasformante” che rende lisce le colonie di batteri a colonie rugose. by N.A.

1953 - 1984 Da Watson e Cric all’idea del sequenziamento by N.A.

Informazione illeggibile! La doppia elica 1953: Watson e Crick propongono il modello a doppia elica per la molecola del DNA. Watson, J.D. & Crick, F.H.C. “A structure for deoxyribose nucleic acid”. Nature, 171, 737 - 738, (1953). Base molecolare nota. Informazione illeggibile! by N.A.

Il codice genetico U C A G 1966: Nirenberg, Khorana e Holley determinano il codice genetico -> a ogni tripletta corrisponde un amminoacido e viceversa (... quasi). In questo stadio della genetica è più facile sequenziare le proteine e dalla successione degli aminoacidi dedurre la sequenza nucleotidica. U C A G UUU UUC F fenilal UCU UCC S serina UAU UAC Y tirosina UGU UGC C cisteina UUA UUG L leucina UCA UCG UAA UAG STOP UGA UGG W triptof CUU CUC CCU CCC P prolina CAU CAC H istidina CGU CGC R arginin CUA CUG CCA CCG CAA CAG Q glutam CGA CGG AUU AUC I isoleuc ACU ACC T treonina AAU AAC N asparag AGU AGC AUA AUG M metion ACA ACG AAA AAG K lisina AGA AGG GUU GUC V valina GCU GCC A alanina GAU GAC D Acaspar GGU GGC G glicina GUA GUG GCA GCG GAA GAG E Acgluta GGA GGG U C A G by N.A.

Tappe 1968: purificazione del primo enzima di restrizione. 1969: le università americane si collegano ad ARPANET, l’antenato di INTERNET 1973: mappa di restrizione di SV40 e clonaggio del primo plasmide DNA genomico digerito caricato su gel con EtBr Lastra sviluppata dopo esposizione del filtro ottenuto dopo trasferimento e ibridazione con sonda marcata radioattivamente(P32) 1974: Ed Southern mette a punto la tecnica che prendera’ il suo nome: il Southern Blot. by N.A.

Tappe 1977: Gilbert e Sanger inventano un sistema per sequenziare “rapidamente” una molecola di DNA. Si determinano alcune decine bp/mese uomo (mu). 1983: grazie alle nuove sonde e agli RFLP viene mappato per linkage il locus della Corea di Huntington. Si apre la possibilita’ di mappare geneticamente anche quegli organismi non accessibili dalla genetica classica basata sugli incroci e si puo’ fare il linkage utilizzando “il fenotipo” del DNA 1985: Mullis concepisce la PCR (polymerase chain reaction) 1986: Hood realizza il primo sequenziamento automatico (-> Mb/mu) 1988: Vengono costruiti gli YAC che possono contenere fino a 2Mb by N.A.

Tappe : gli STS 1989: L’automazione del sequenziamento permette di sequenziare corte sequenze (~200pb) clonate a caso da cui ricavare primers per “screenare” con la PCR ormai automatizzata le librerie e costruire mappe fisiche attraverso la creazione di contigui . Quando sono polimorfiche sono marcatori comuni alle mappe sia genetiche che fisiche e permettono di legarle fra loro H F* Q A* C B* D G* mappa fisica: contiguo 1 2 A C B D G H F Q DNA genomico A+,B-,C+.. A-,B+,C+.. B+,D+,G+ H+,F+,T-.. F+,T-,Q+.. Clonaggio mappa genetica: A, G e F sono in linkage il loro ordine e’ F-A-G Sequenziamento A C B D G H F Q I due contigui sono sullo stesso cromosoma e via cosi.... screening library con PCR GACTTAG........CATAGCA ~200bp scelta dei primers x A,B,C.. STS A,B,C.. by N.A.

Tappe 1992: I BAC:possibilita’ di clonare frammenti molto grandi (fino a 200Kb) e stabili a differenza degli YAC. 1994: I PAC possono sopportare frammenti genomici piu’ piccoli (fino a 100-120Kb) 1998: Gli SNPs: nuova generazione di polimorfismi del DNA: sono sostituzioni di singole basi, con frequenza ogni poche centinaia di basi, sono stati individuati grazie all’automazione del sequenziamento, permetteranno di generare mappe genetiche ad alta densita’ by N.A.

Studiare un genoma Studiare un genoma significa : clonare le sue sequenze, ordinare i cloni per ricomporre l’organizzazione spaziale delle sequenze comprendere l’architettura del genoma identificando i diversi tipi di DNA e la loro distribuzione identificare i geni e la loro funzione studiarne l’evoluzione attraverso il confronto con altri genomi by N.A.

Come identificare i geni Analisi al computer A1:Omologo animale mappato? A2:Omologo clonato? A3:Ricerca nei database genetici Informazioni cliniche C1:raccolta famiglie per mappatura C2:delezioni o traslocazioni cromosomiche C5:Raccolta pazienti non imparentati Informazioni di laboratorio D1:mappatura genetica: ricerca genomica D2:clonaggio dei punti di rottura D3:nuovi geni umani identificati D4:struttura genomica e sequenza completa D5:Ricerca delle mutazioni B1:regione cromosomica candidata? B2:Verifica nei database dei geni della regione B3:Possibile gene candidato? B4:e’ stato completamente caratterizzato? E1:trovata la localizzazione? E2: errore nel tipo di eredita’ o eterogeneita’ genetica E3:ripensare ai geni candidati: vai A2,A3,D3 E5:trovate mutazioni patogene? SI NO TROVATO!!! SI by N.A.

Strategie CLONAGGIO FUNZIONALE: le basi biochimiche della funzione in studio sono note. Utile in pochi casi CLONAGGIO POSIZIONALE: si conosce solo la localizzazione cromosomica del locus. Richiede la costruzione di una mappa fisica e genetica della regione. STRATEGIE CON GENE CANDIDATO INDIPENDENTI DALLA LOCALIZZAZIONE: e’ necessario correlare il fenotipo a modelli animali o porre in relazione il fenotipo a famiglie geniche gia’ note STRATEGIE CON GENE CANDIDATO CONOSCENDO LA LOCALIZZAZIONE: sono quelle attualmente piu’ utilizzate, soprattutto per la possibilita’ di utilizzare le banche dati. by N.A.

Attenzione Le strategie sono alternative, la scelta dipende dalle informazioni di partenza , ma ovviamente nel corso dello studio si integrano: praticamente alla fine si usano tutte. Non esiste quella giusta in assoluto esiste quella che mi puo’ dare maggiori risultati nelle condizioni sperimentali in cui mi trovo ad operare by N.A.

Studiare un genoma Studiare un genoma significa : clonare le sue sequenze, ordinare i cloni per ricomporre l’organizzazione spaziale delle sequenze comprendere l’architettura del genoma identificando i diversi tipi di DNA e la loro distribuzione identificare i geni e la loro funzione studiarne l’evoluzione attraverso il confronto con altri genomi Bisogna avere delle mappe collegate fra loro perche’ una sola non basta: by N.A.

Tipi di mappe: mappe fisiche Mappe fisiche: sono come le mappe geografiche. Descrivono la posizione fisica dei cloni di una libreria genomica uno relativamente all’altro sulla base della loro sequenza Se riesco ad allinearle con le mappe genetiche posso collegare un gruppo di cloni a un locus e cominciare a rispondere alla domanda ultima di tutto il lavoro: La sequenza clonata e’ il gene che sto cercando? by N.A.

Tipi di mappe: mappe genetiche Mappe genetiche : si basano sulla frequenza di ricombinazione fra locus identificati attraverso marcatori di varia natura: fenotipo dell’ individuo, fenotipo tissutale, fenotipo cellulare, fenotipo proteico, fenotipo del DNA. Sono la connessione fra una realta’ biologica e il genoma corrispondente, senza di loro spesso non si puo’ procedere, non si puo’ rispondere alla domanda ultima di tutto il lavoro: La sequenza clonata e’ il gene che sto cercando? by N.A.

Tipi di mappe: mappe di espressione Mappe di espressione: ordinano all’interno di una regione gli RNA espressi. Il DNA codificante costituisce una frazione del DNA di un organismo quindi e’ necessario collegare le mappe fisiche e genetiche a una mappa di espressione per evitare di concentrarsi su sequenze non idonee a rispondere alla domanda ultima di tutto il lavoro: La sequenza clonata e’ il gene che sto cercando? by N.A.

Le mappe fisiche Mappe fisiche: sono come le mappe geografiche. Descrivono la posizione fisica dei cloni di una libreria genomica uno relativamente all’altro sulla base della loro sequenza Ne esistono di diversi tipi che forniscono informazioni complementari: mappe da ibridi di cellule somatiche e da radiazione, mappe di restrizione a lungo raggio mappe basate su cloni utilizzando STS e EST mappe ottenute con FISH by N.A.

Le mappe fisiche Mappe fisiche: sono come le mappe geografiche. Descrivono la posizione fisica dei cloni di una libreria genomica uno relativamente all’altro sulla base della loro sequenza Ne esistono di diversi tipi che forniscono informazioni complementari: mappe da ibridi di cellule somatiche e da radiazione, Si originano dalla fusione in vitro del genoma di due specie e dalla susseguente origine di una linea cellulare che contiene nel suo nucleo i cromosomi della linea accetrice e alcuni cromosomi o parti di essi della donatrice by N.A.

Creazione degli ibridi somatici Donatrice Accettrice X +PEG Eterocarionte binucleato X Sincarionte X Ibrido Selezione .::. X by N.A.

Pannello di RH per il crom.5 caratterizzato con STS by N.A.

Tipi di mappe: mappe genetiche Mappe genetiche : si basano sulla frequenza di ricombinazione fra locus identificati attraverso marcatori di varia natura: fenotipo dell’ individuo, fenotipo tissutale, fenotipo cellulare, fenotipo proteico, fenotipo del DNA. Sono la connessione fra una realta’ biologica e il genoma corrispondente, senza di loro spesso non si puo’ procedere, by N.A.

Le mappe genetiche Si basano sugli studi di linkage cioe’ sull’analisi della segregazione alla meiosi di marcatori genetici. Se due o piu’ marcatori vengono ereditati preferenzialmente nelle combinazioni parentali si deduce che mappino nella stessa regione genomica Ricordate? L’unita’ di mappa e’ il centimorgan(cM): 1cM indica che due locus ricombinano fra loro con una frequenza pari a 0.01. Si assume che 1cM sia pari a ~1.5Mb anche se la relazione diretta non c’e’: la mappa genetica puo’ essere piu’ lunga di quella fisica. by N.A.

Linkage:fase di piu locus Definizione della regione candidata con analisi di linkage: ricostruzione degli aplotipi studiando la segregazione nelle famiglie. E’ necessario risalire alla fase e identificare i ricombinanti 7 5 4 6 2 8 3 1 9 8 3 2 7 10 10 4 6 1 8 3 2 7 10 10 3 2 5 8 8 3 2 7 10 5 3 1 7 8 3 4 2 10 3 2 5 8 Possedere un particolare polimorfismo non vuol dire avere il fenotipo, lo studio di linkage e’ a livello di popolazione, serve ad individuare una regione non la mutazione by N.A.

Polimorfismo Variazione presente nella popolazione con una frequenza superiore a 1% Variazioni nell’aspetto by N.A.

Polimorfismo Polimorfismi proteici Variazione presente nella popolazione con una frequenza superiore a 1% Polimorfismi proteici Polimorfismi del DNA: di restrizione (RFLP), minisatellite, microsatellite. Individuabili con southern blotting o PCR by N.A.

La connessione fra mappe Quindi si hanno due tipi di mappe: fisica e genetica. Il problema e’ trovare il modo di legarle: la mappa fisica mi dice in che un gruppo di sequenze formano un contiguo su un frammento di cromosoma, ma non mi permette di identificare geni candidati. La mappa genetica me lo permetterebbe perche’ non riguarda specifiche sequenze, ma anche locus di cui non conosco la sequenza. Non posso pero’ studiare il gene candidato perche’ non ho la sequenza corrispondente. La possibilita’ di utilizzare STS e EST polimorfici ha permesso di risolvere il problema by N.A.

Gli STS: Sequence Target Site L’automazione del sequenziamento permette di sequenziare corte sequenze (300pb) clonate a caso da cui ricavare primers per “screenare” con la PCR ormai automatizzata le librerie e costruire mappe fisiche attraverso la creazione di contigui . Quando sono polimorfiche sono marcatori comuni alle mappe sia genetiche che fisiche e permettono di legarle fra loro H F* Q A* C B* D G* mappa fisica:contiguo 1 2 A C B D G H F Q DNA genomico A+,B-,C+.. A-,B+,C+.. B+,D+,G+ H+,F+,T-.. F+,T-,Q+.. Clonaggio mappa genetica: A, G e F sono in linkage il loro ordine e’ F-A-G Sequenziamento A C B D G H F Q I due contigui sono sullo stesso cromosoma e via cosi.... screening library con PCR GACTTAG........CATAGCA ~300bp scelta dei primers x A,B,C.. STS A,B,C.. by N.A.

Studiare un genoma Studiare un genoma significa : clonare le sue sequenze, ordinare i cloni per ricomporre l’organizzazione spaziale delle sequenze comprendere l’architettura del genoma identificando i diversi tipi di DNA e la loro distribuzione identificare i geni e la loro funzione studiarne l’evoluzione attraverso il confronto con altri genomi by N.A.

Come identificare i geni Analisi al computer A1:Omologo animale mappato? A2:Omologo clonato? A3:Ricerca nei database genetici Informazioni cliniche C1:raccolta famiglie per mappatura C2:delezioni o traslocazioni cromosomiche C5:Raccolta pazienti non imparentati Informazioni di laboratorio D1:mappatura genetica: ricerca genomica D2:clonaggio dei punti di rottura D3:nuovi geni umani identificati D4:struttura genomica e sequenza completa D5:Ricerca delle mutazioni B1:regione cromosomica candidata? B2:Verifica nei database dei geni della regione B3:Possibile gene candidato? B4:e’ stato completamente caratterizzato? E1:trovata la localizzazione? E2: errore nel tipo di eredita’ o eterogeneita’ genetica E3:ripensare ai geni candidati: vai A2,A3,D3 E5:trovate mutazioni patogene? SI NO TROVATO!!! SI by N.A.

Strategie CLONAGGIO FUNZIONALE: le basi biochimiche della funzione in studio sono note. Utile in pochi casi CLONAGGIO POSIZIONALE: si conosce solo la localizzazione cromosomica del locus. Richiede la costruzione di una mappa fisica e genetica della regione. STRATEGIE CON GENE CANDIDATO INDIPENDENTI DALLA LOCALIZZAZIONE: e’ necessario correlare il fenotipo a modelli animali o porre in relazione il fenotipo a famiglie geniche gia’ note STRATEGIE CON GENE CANDIDATO CONOSCENDO LA LOCALIZZAZIONE: sono quelle attualmente piu’ utilizzate, soprattutto per la possibilita’ di utilizzare le banche dati. by N.A.

Richiamiamo un po’ di terminologia Genotipo: costituzione genetica di un individuo in relazione ad un particolare carattere Fenotipo: manifestazione fisica del carattere, non e’ necessariamente una patologia intesa in senso clinico La manifestazione fisica dipende dal metodo di rilevazione: es. anemia falciforme, thalassemia, emoglobinopatie E’ l’operatore che sceglie il livello di indagine e definisce il fenotipo che vuole seguire: l’individuo, gli organi, il tessuto, le cellule, il DNA... Locus: regione genomica dove mappa la sequenza di DNA coinvolta nella manifestazione del fenotipo. E’ individuato utilizzando tecniche laboratoristiche diverse: biochimiche, molecolari, citogenetiche by N.A.

Gene e fenotipo il “gene” mendeliano e’ un entita’ astratta identificata dalla modalita’ di segregazione e dalla mappatura in un LOCUS il “gene” molecolare e’ una sequenza codificante corrispondente ad un trascritto, che mappa nella regione identificata dal locus Non esiste necessariamente corrispondenza 1:1 fra fenotipo mendeliano e sequenze codificanti by N.A.

Gene e fenotipo Non esiste necessariamente corrispondenza 1:1 fra fenotipo mendeliano e sequenze codificanti Charcot Marie Tooth 1A ,fenotipo autosomico dominante: la mutazione piu’ frequente e’ una duplicazione di un frammento genomico di 1.5Mb che comprende parecchi geni. Prader-Willi/Angelmann,fenotipi autosomici dominanti: la mutazione piu’ frequente e’ la delezione di un segmento genomico che puo’ arrivare a 4Mb by N.A.

Richiamiamo un po’ di terminologia Autosomico: locus che mappa su un autosoma Legato al sesso : locus che mappa sui cromosomi sessuali Alleli: forme alternative del locus che originano fenotipi distinguibili. Nella popolazione possono esistere n alleli, ma ogni individuo diploide ne possiede 2 degli n possibili. Gli alleli si originano per effetto delle mutazioni, e generano variabilita’ nella popolazione. Non e’ detto che ci sia un allele che genera fenotipo patologico. (gruppi sanguigni) Omozigote: individuo in cui entrambi gli alleli sono uguali Eterozigote: individuo in cui gli alleli di un locus sono differenti Ricordare che omozigote ed eterozigote non sono sinonimi di dominante e recessivo by N.A.

Definizione classica Dominante: Carattere che si manifesta in eterozigosi Recessivo: Carattere che si manifesta in omozigosi SONO CONCETTI CHE SI RIFERISCONO ALLA MODALITA’ DI TRASMISSIONE E DIPENDONO DAL TIPO DI FENOTIPO CHE SI CONSIDERA: ANEMIA FALCIFORME: Recessivo se considero come fenotipo la presenza dell’anemia: i portatori non hanno anemia Codominante se considero le catene dell’emoglobina : sono presenti entrambe Se guardo la sequenza del DNA non e’ nell’una nell’altra, perche’ non sto guardando l’espressione del prodotto by N.A.

Definizione classica Dominante: Carattere che si manifesta in eterozigosi Recessivo: Carattere che si manifesta in omozigosi SONO CONCETTI CHE SI RIFERISCONO ALLA MODALITA’ DI TRASMISSIONE Da questo deriva che la terminologia A/a che correttamente si usa negli incroci quando si vuole indicare la relazione fra i prodotti degli alleli e’ una terminologia operativa: significa che il fenotipo originato da un allele non e’ evidenziabile se c’e’ l’allele A e quindi mi devo aspettare che soggetti con fenotipo A siano geneticamente Aa e questa informazione mi viene dall’analisi degli alberi genealogici o dall’incrocio Inoltre va ricordato che anche utilizzando A/a non vuol dire che a e’ derivato da A e costituisce un sottoprodotto di A. La terminologia che si deve usare al di fuori dello studio della trasmissione e’: locus A alleli A1,A2, A3, An.. (locus white in Drosophila) by N.A.

Dominanza e recessivita’ SONO CONCETTI CHE SI RIFERISCONO ALLA MODALITA’ DI TRASMISSIONE SONO DOVUTI ALL’INTERAZIONE DEL PRODOTTO DEI SINGOLI LOCUS CON L’AMBIENTE, IL BACKGROUND GENETICO DEL SINGOLO INDIVIDUO E IL PERIODO DELLO SVILUPPO E DIFFERENZIAMENTO SI APPLICANO PERCIO’ ALLA POPOLAZIONE NON ALL’INDIVIDUO A LIVELLO DI POPOLAZIONE MEGLIO PARLARE DI LOCUS: IL TERMINE GENE ASSUME SIGNIFICATI DIVERSI A SECONDA DEL TIPO DI INDAGINE LA GENETICA UMANA E’ FORSE L’ULTIMA DISCIPLINA CHE VIENE APPLICATA AD UNA POPOLAZIONE NATURALE by N.A.

Dominanza e recessivita’ Non si applicano al gene inteso come sequenza di DNA o locus. In alcune patologie (es.Fibrosi Cistica) gli affetti possono essere definiti eterozigoti composti:questo perche’ esistono mutazioni diverse che provocano la malattia. Di fatto gli affetti non hanno l’allele normale, ma due alleli patologici. Geneticamente sono eterozigoti perche’ hanno due alleli diversi, ma dal punto di vista fenotipico sono indistinguibili dagli omozigoti. Il carattere e’ comunque recessivo Si puo’ continuare ad usare il termine dominante e recessivo, ma va tenuto ben presente il significato e soprattutto non va confuso con: dominante=+diffuso, recessivo=patologico, dominante=normale etc.... by N.A.

Clonaggio funzionale si parte da D3 Analisi al computer Informazioni cliniche Informazioni di laboratorio A1:Omologo animale mappato? B1:regione cromosomica candidata? C1:raccolta famiglie per mappatura D1:mappatura genetica: ricerca genomica E1:trovata la localizzazione? SI NO SI NO NO SI E2: errore nel tipo di eredita’ o eterogeneita’ genetica A2:Omologo animale clonato? C2:delezioni o traslocazioni cromosomiche D2:clonaggio dei punti di rottura B2:Verifica nei database dei geni della regione D3:nuovi geni umani identificati E3:ripensare ai geni candidati: vai A2,A3,D3 A3:Ricerca nei database genetici B3:Possibile gene candidato? D4:struttura genomica e sequenza completa B4:e’ stato completamente caratterizzato? NO NO C5:Raccolta pazienti non imparentati E5:trovate mutazioni patogene? D5:Ricerca delle mutazioni SI TROVATO!!! SI by N.A.

Albinismo: Tirosinasi Clonaggio funzionale Creazione di una library di cDNA in vettore di espressione Produzione di anticorpi specifici Screening della library di espressione e isolamento della colonia Ricerca nei topi del DNA corrispondente al cDNA clonato Sequenza dei cDNA cercando una ORF Screening di una library di DNA genomico per isolare la sequenza completa Analisi del DNA degli affetti per individuare le mutazioni Albinismo: Tirosinasi EMOFILIA A: deficienza del fattore VIII FENILCHETONURIA: deficienza fenilalanina-idrossilasi by N.A.

Clonaggio funzionale si parte da A1 Analisi al computer Informazioni cliniche Informazioni di laboratorio A1:Omologo animale mappato? B1:regione cromosomica candidata? C1:raccolta famiglie per mappatura D1:mappatura genetica: ricerca genomica E1:trovata la localizzazione? SI NO SI NO NO SI E2: errore nel tipo di eredita’ o eterogeneita’ genetica A2:Omologo animale clonato? C2:delezioni o traslocazioni cromosomiche D2:clonaggio dei punti di rottura B2:Verifica nei database dei geni della regione D3:nuovi geni umani identificati E3:ripensare ai geni candidati: vai A2,A3,D3 A3:Ricerca nei database genetici B3:Possibile gene candidato? D4:struttura genomica e sequenza completa B4:e’ stato completamente caratterizzato? NO NO C5:Raccolta pazienti non imparentati E5:trovate mutazioni patogene? D5:Ricerca delle mutazioni SI TROVATO!!! SI by N.A.

Variante: identificazione conoscendo la funzione normale Complementazione nel topo transgenico:il gene DFNB3 identificato grazie al gene di topo. Il topo shaker2 ha una patologia vestibolare che si riconosce perche’ gira su se stesso e scuote la testa. topo shaker2 topo sh2/sh2 Wild type X Si iniettano uova sh2/sh2 con BAC di topo wt. Mappato per linkage in 1cM del cromosoma11 di topo(17 umano) topo sh2/sh2 topo sh2/sh2 Si isola il BAC umano con primer esonici e si isola la sequenza umana, cercano le mutazioni nei pazienti topo sh2/sh2 Wild type BAC### Si sequenzia il BAC murino e si cercano le mutazioni nei topi mutanti si identifica il gene e la sua funzione by N.A.

Variante: identificazione conoscendo la funzione normale Isolamento di oncogeni attivati: cellule di topo vengono trasfettate con DNA derivato da un tumore umano, se crescono in maniera incontrollata vuol dire che contengono un oncogene Selezione di una colonia trasformata Trasfezione di frammenti di DNA umano da tumore ricerca sequenze Alu Alcune cellule sono trasformate Coltura di cellule NIH-3T3 di topo fagi che potrebbero contenere l’oncogene by N.A.

Strategie CLONAGGIO POSIZIONALE: si conosce solo la localizzazione cromosomica del locus. Richiede la costruzione di una mappa fisica e genetica della regione. Si utilizza sempre meno by N.A.

Clonaggio posizionale CLONAGGIO POSIZIONALE: si conosce solo la localizzazione cromosomica del locus. richiede la costruzione di una mappa fisica e genetica della regione. Definizione della regione candidata con analisi di linkage: ricostruzione degli aplotipi studiando la segregazione nelle famiglie Anomalie cromosomiche: ricerca del coinvolgimento di una stessa regione in affetti con lo stesso fenotipo Screening della perdita di eterozigosi: utilizzata di solito per i tumori o quando vi sono indicazioni di delezioni Corea di Huntington, distrofia di Duchenne, fibrosi cistica, neurofibromatosi, cancro colon-rettale….. by N.A.

Clonaggio posizionale si parte da C1 Analisi al computer Informazioni cliniche Informazioni di laboratorio A1:Omologo animale mappato? B1:regione cromosomica candidata? C1:raccolta famiglie per mappatura D1:mappatura genetica: ricerca genomica E1:trovata la localizzazione? SI NO SI NO NO SI E2: errore nel tipo di eredita’ o eterogeneita’ genetica A2:Omologo animale clonato? C2:delezioni o traslocazioni cromosomiche D2:clonaggio dei punti di rottura B2:Verifica nei database dei geni della regione D3:nuovi geni umani identificati E3:ripensare ai geni candidati: vai A2,A3,D3 A3:Ricerca nei database genetici B3:Possibile gene candidato? D4:struttura genomica e sequenza completa B4:e’ stato completamente caratterizzato? NO NO C5:Raccolta pazienti non imparentati E5:trovate mutazioni patogene? D5:Ricerca delle mutazioni SI TROVATO!!! SI by N.A.

Come identificare i geni Analisi al computer A1:Omologo animale mappato? A2:Omologo clonato? A3:Ricerca nei database genetici Informazioni cliniche C1:raccolta famiglie per mappatura C2:delezioni o traslocazioni cromosomiche C5:Raccolta pazienti non imparentati Informazioni di laboratorio D1:mappatura genetica: ricerca genomica D2:clonaggio dei punti di rottura D3:nuovi geni umani identificati D4:struttura genomica e sequenza completa D5:Ricerca delle mutazioni B1:regione cromosomica candidata? B2:Verifica nei database dei geni della regione B3:Possibile gene candidato? B4:e’ stato completamente caratterizzato? E1:trovata la localizzazione? E2: errore nel tipo di eredita’ o eterogeneita’ genetica E3:ripensare ai geni candidati: vai A2,A3,D3 E5:trovate mutazioni patogene? SI NO TROVATO!!! SI by N.A.

Cos’e’ il tumore Le alterazioni genetiche acquisite che portano alla trasformazione maligna sono un esempio di variazione genetica somatica (oltre al mosaicismo per i caratteri genetici nucleari e all’eteroplasmia per le mutazioni mitocondriali). Il tumore ha un’origine clonale, essendo il suo sviluppo innescato da un’alterazione genetica in una singola cellula E’ l’accumulo di alterazioni genetiche in una singola cellula che produce gli effetti fenotipici caratteristici del termine “malignita’ ”. by N.A.

Gene Rb del retinoblastoma I geni nei tumori I geni alterati nel cancro sono definiti oncogeni: questo nome deriva dalla scoperta di geni virali responsabili della trasformazione in tumore delle cellule infettate oncosoppressori proto-oncogeni caretaker (addetti alla manutenzione) landscapers (architetti del paesaggio) Gene Rb del retinoblastoma by N.A.

Retinoblastoma e’ un tumore maligno della retina che si sviluppa nei primi anni di vita puo’ essere monolaterale (solo un occhio colpito) o bilaterale (entrambi gli occhi) si puo’ manifestare in forme sporadiche o ereditarie diagnosticate a 7-10 anni, generalmente monofocali (solo in un punto dell’occhio) diagnosticate nel primo anno di vita, multifocali (piu’ punti di un occhio) by N.A.

Genetica del retinoblastoma retinoblastoma bilaterale retinoblastoma monolaterale non-penetrante Apparente trasmissione dominante... by N.A.

Alfred Knudson Osservo’ che: Nel 1971 Alfred Knudson analizzo’ casi di bambini con retinoblastoma sia monolaterale che bilaterale Osservo’ che: al momento della diagnosi, i bambini che avrebbero sviluppato tumori bilaterali erano piu’ piccoli di quelli per i quali i tumori sarebbero rimasti monolaterali; con l’aumentare dell’eta’, la frequenza con cui venivano diagnosticati i casi bilaterali cresceva in maniera esponenziale, mentre quella relativa ai casi monolaterali aumentava molto piu’ lentamente. by N.A.

Knudson propose un modello (two-hit hypothesis) secondo il quale, affinche’ si abbia il retinoblastoma, e’ necessario che in una linea di cellule retiniche si verifichino due distinti eventi mutazionali I evento (“hit”) II evento (“hit”) I soggetti con retinoblastoma ereditario hanno ereditato una di queste mutazioni, la quale, pertanto, e’ presente in tutte le loro cellule retiniche e, quindi, e’ necessario un secondo evento perche’ si produca il tumore. Il retinoblastoma sporadico, invece, si forma solo quando due eventi mutazionali indipendenti avvengono nella stessa linea cellulare. Cio’ si realizza piu’ raramente, per cui l’insorgenza e’ piu’ tardiva e i tumori sono invariabilmente monolaterali. by N.A.

Il gene del retinoblastoma (Rb) Il primo indizio sulla posizione del gene Rb e’ stato fornito da soggetti rari affetti da retinoblastomi bilaterali, concomitanti anomalie congenite e assenza di familiarita’ L’analisi cromosomica di questi pazienti ha dimostrato la presenza di una delezione del braccio lungo del cromosoma 13 di dimensione variabile ma con condivisione delle bande 13q13-q14: questa osservazione suggeriva che in tale regione si localizzasse un gene predisponente al retinoblastoma delezione 13q13-q14 by N.A.

Rb ed esterasi Questi bambini presentavano anche una delezione di una copia del gene per l’enzima esterasi D, enzima di funzione sconosciuta ma facilmente dosabile. Presenta un polimorfismo con due alleli, evidenziabile mediante elettroforesi di proteine. I bambini con una delezione a carico di 13q14 producevano meta’ della quantita’ normale di esterasi D ed esprimevano invariabilmente un solo allele. L’esterasi con il suo polimorfismo era lo strumento ideale per studiare il gene del retinoblastoma by N.A.

Linkage di esterasi e Rb L’analisi di linkage esaminando la segregazione del polimorfismo dell’esterasi D in famiglie con retinoblastoma ereditario e prive di delezione: gli alleli dell’esterasi D segregavano nelle famiglie insieme al carattere retinoblastoma (lod score>3), fornendo indicazione che il gene predisponente alla malattia fosse localizzato a livello della banda 13q14. by N.A.

Verifica dell’ipotesi di Knudson Una mutazione in un gene del cromosoma 13 che costituirebbe al primo evento secondo l’ipotesi di Knudson e’ presente nelle cellule normali dei portatori Il secondo evento sarebbe consistito nella perdita della copia normale rimanente di questo gene... Per testare questa ipotesi si e’ usata nuovamente l’esterasi D, espressa nelle cellule del retinoblastoma, per vedere quali suoi alleli fossero espressi I tumori analizzati erano stati ottenuti da soggetti eterozigoti per il polimorfismo dell’esterasi D e non portatori di delezione costituzionale del cromosoma 13. by N.A.

Verifica dell’ipotesi di Knudson Atteso: entrambi gli alleli avrebbero dovuto essere espressi Osservato: solo un allele viene espresso in 2/3 dei tumori analizzati il secondo evento consisteva probabilmente in una delezione che includeva i loci sia dell’esterasi D che del retinoblastoma ? Per la verifica del secondo evento, si puo’ ricorrere a tecniche di biologia molecolare, come il Southern Blot di DNA dei soggetti di una famiglia affetta usando sonde del cromosoma 13 per testare la perdita di eterozigosita’ (LOH) by N.A.

Perdita di eterozigosita’ LOH famiglia con figlia affetta da retinoblastoma: RFLP dell’esterasi D Cellule tumorali omozigote eterozigote eterozigote LOH by N.A.

LOH La LOH si puo’ applicare sia ai tumori familiari che a quelli sporadici, suggerendo che, in entrambi i casi, gli eventi che conducono allo sviluppo del tumore interessino un locus sul cromosoma 13. C’e’ una cosa da tenere presente: le cellule tumorali hanno lo stesso background genetico delle normali perche’ appartengono allo stesso individuo: le differenze fra loro sono imputabili al processo tumorale, non alla variabilita’ genetica e questo permette di utilizzare anche gli sporadici Nei casi familiari, gli alleli mantenuti nel tumore erano invariabilmente quelli ereditati dal genitore affetto by N.A.

Clonaggio del gene del retinoblastoma la ricerca del gene si è concentrata sulla banda 13q14 e si sono cercate le sequenze espresse nelle cellule retiniche normali, che risultassero mutate nei soggetti affetti da retinoblastoma familiare il punto di partenza è stato fornito dalla scoperta di un gruppo di tumori che presentavano una delezione omozigote corrispondente ad una sequenza di DNA clonata dalla regione 13q14 by N.A.

Clonaggio del gene del retinoblastoma Nel retinoblastoma il trascritto era assente o di dimensioni molto diversi dal normale pazienti con retinoblastoma ereditario portatori di tumori con delezioni omozigoti presentavano delezioni eterozigoti nei tessuti costituzionali..... Ipotesi di Knudson confermata! Rb e’ un oncosoppressore by N.A.

Ricerca delle mutazioni In molti casi le mutazioni non consistono in delezioni o alterazioni a carico del gene tali da poter essere individuate con Southern blot, ma in mutazioni puntiformi piu’ difficili da evidenziare test molecolare: sequenziamento esonico dopo PCR per rivelarle by N.A.

Altri oncosoppressori by N.A.

Modalita’ di espressione Gli oncosoppressori vengono definiti recessivi. Perche? Perche’ per manifestare il fenotipo e’ necessario che entrambi gli alleli siano mutati (anche se le mutazioni possono essere diverse) Attenzione: in questo caso il fenotipo di cui si parla e’ quello della cellula non dell’individuo! Il tumore va considerato come un “individuo” : all’interno dell’organismo ci sono cloni (“individui”) che non manifestano il fenotipo perche’ hanno un allele wild-type. Una cellula di questi cloni per caso muta l’allele wild-type: perde la funzione e si manifesta il tumore Gli oncosoppressori sono geni la cui funzione normale non e’ sensibile alla quantita’ di prodotto: il mancato funzionamento di un allele non ne pregiudica la funzione. by N.A.

by N.A.