Trascrizione nei procarioti e negli eucarioti Regolazione dell’espressione genica

Trascrizione Processo mediante il quale l’informazione contenuta in una sequenza di DNA (gene) viene copiata in una sequenza complementare di RNA dall’enzima RNA polimerasi

Solo una frazione del genoma viene trascritta e tradotta, quella CODIFICANTE Trend evolutivo: con l’aumentare delle dimensioni del genoma, aumenta la frazione non codificante 4300 geni 6X Genomi compatti e non <25000 geni 700X dimensioni: 4,7 12,1 100 3300 Mb

Nei procarioti i singoli geni sono separati da brevi sequenze non codificanti Gene 1 Gene 2 Gene 3 Negli eucarioti i singoli geni sono separati da lunghissime sequenze non codificanti Gene 1 Gene 2 Gene 3

DNA non codificante Più del 98% del genoma umano è composto da sequenze non codificanti 26% del genoma umano è rappresentato da regioni introniche e sequenze regolatrici 44% del genoma umano è rappresentato da DNA altamente ripetuto: elementi trasponibili (elementi in grado di copiarsi e poi di integrarsi in altre posizioni del genoma) Non coding RNA (regolazione della trascrizione genica, inattivazione cromosoma X) Alcuni tratti di junk DNA sono conservati http://www.pikaia.eu/EasyNe2/Notizie/Un_tour_guidato_tra_i_genomi_piu_grandi.aspx http://www.pikaia.eu/EasyNe2/Notizie/L_invasione_degli_ultracorpi.aspx http://papers.gersteinlab.org/e-print/sciam2/reprint.pdf (Mark Gerstein and Deyou Zheng 2006 Scientific American) Coding + introni c.a. 28% Trasposoni: parassiti cellulari < 5% RNA della cellula è mRNA 8% del genoma umano è di origine retrovirale (300Mb), l’1.5-2% è coding (48Mb): nel nostro genoma abbiamo 6 volte più sequenze di origine virale rispetto a quelle codificanti. Sincizina è proteina di origine retrovirale che serve a fare sincizi e ha permesso ai mammiferi placentati di produrre la placenta. Proteina di origine virale utilizzata da noi!!! 48Mb coding / 24000 geni = 2000bp lunghezza media di un gene; 600aa lunghezza media di una proteina

Esempio di non coding RNA: XIST e inattivazione del cromosoma X nelle femmine di mammifero Due cromosomi X attivi (primi stadi di sviluppo embrionale) Trascrizione XIST asimmetrica XIST http://www.nature.com/nsmb/journal/v17/n8/full/nsmb.1877.html http://php.med.unsw.edu.au/embryology/index.php?title=Molecular_Development_-_X_Inactivation XIST diffonde e si lega solo al cromosoma X che l’ha prodotto, causandone la condensazione e inattivazione

Esempio di non coding RNA: XIST e inattivazione del cromosoma X

Esempio di non coding RNA: XIST e inattivazione del cromosoma X http://www.nature.com/nsmb/journal/v17/n8/full/nsmb.1877.html http://php.med.unsw.edu.au/embryology/index.php?title=Molecular_Development_-_X_Inactivation

DNA non codificante Più del 98% del genoma umano è composto da sequenze non codificanti 26% del genoma umano è rappresentato da regioni introniche e sequenze regolatrici 44% del genoma umano è rappresentato da DNA altamente ripetuto: elementi trasponibili (elementi in grado di copiarsi e poi di integrarsi in altre posizioni del genoma) Non coding RNA (regolazione della trascrizione genica, inattivazione cromosoma X) MARs (Matrix attachment regions) condensazione della cromatina Pseudogeni (c.a. 20.000 sequenze simili a geni ma non più funzionanti) …. Alcuni tratti di junk DNA sono conservati http://www.pikaia.eu/EasyNe2/Notizie/Un_tour_guidato_tra_i_genomi_piu_grandi.aspx http://www.pikaia.eu/EasyNe2/Notizie/L_invasione_degli_ultracorpi.aspx http://papers.gersteinlab.org/e-print/sciam2/reprint.pdf (Mark Gerstein and Deyou Zheng 2006 Scientific American) Coding + introni c.a. 28% Trasposoni: parassiti cellulari < 5% RNA della cellula è mRNA 8% del genoma umano è di origine retrovirale (300Mb), l’1.5-2% è coding (48Mb): nel nostro genoma abbiamo 6 volte più sequenze di origine virale rispetto a quelle codificanti. Sincizina è proteina di origine retrovirale che serve a fare sincizi e ha permesso ai mammiferi placentati di produrre la placenta. Proteina di origine virale utilizzata da noi!!! 48Mb coding / 24000 geni = 2000bp lunghezza media di un gene; 600aa lunghezza media di una proteina

Origine pseudogeni. Esempio: geni globinici Duplicazione 500 milioni anni fa Divergenza per accumulo mutazioni trasposizione Duplicazioni + mutazioni http://bio1151b.nicerweb.com/Locked/media/ch21/duplication.html duplicazione genica + divergenza evolutiva = acquisizione di nuove funzioni / inattivazione del gene (ψ)

Trascrizione gene Filamento stampo (coding strand) Complementarietà, un solo strand coding, Uracile

Geni posti sullo stesso cromosoma possono avere come “coding strand” filamenti diversi del DNA http://www.mun.ca/biology/scarr/MGA2_03-05.html

Visione d’insieme della trascrizione

Inizio della trascrizione la RNA polimerasi si lega al DNA in corrispondenza del promotore e “copia” il filamento di DNA stampo a partire dal sito di inizio della trascrizione

Alfa amanitina inibisce le RNA pol eucariotiche Polipeptide biciclico http://it.wikipedia.org/wiki/Amanitina http://www.pianetachimica.it/mol_mese/mol_mese_2003/04_RNA_Polimerasi/RNA_Polimerasi_2_ita.html L'avvelenamento con le amanitine è caratterizzato da un lungo periodo di latenza (dalle 6 alle 48 ore, in media 6-15 ore) durante il quale il paziente non accusa alcun sintomo.

Il promotore è una sequenza specifica del DNA che viene riconosciuta dalla RNA polimerasi e determina DOVE la sintesi del mRNA inizia e QUALE filamento del DNA debba essere utilizzato come stampo. Sito di inizio della denaturazione Promotore procariotico

Allungamento della catena dell’RNA I due filamenti di DNA si svolgono e il DNA può essere copiato. La RNA polimerasi, a differenza della DNA polimerasi, non ha bisogno di un innesco Procarioti: RNA polimerasi si lega direttamente al promotore Eucarioti: fattori di trascrizione legano il promotore prima dell’ RNA polimerasi II

Allungamento della catena dell’RNA A differenza delle DNA polimerasi, le RNA polimerasi non hanno attività “proof reading”

Allungamento della catena dell’RNA 3’

Terminazione Sequenze specifiche sul DNA (terminator) determinano l’arresto della trascrizione in corrispondenza di un determinato nucleotide (STOP site)

* Nei PROCARIOTI esiste una sola RNA polimerasi che trascrive i vari tipi di RNA: rRNA  RNA ribosomale mRNA proteine tRNA  RNA di trasferimento ** Negli EUCARIOTI esistono tre RNA polimerasi distinte: RNA polimerasi I  rRNA RNA polimerasi II mRNA RNA polimerasi III  tRNA ma questa non è la sola differenza….

Nei procarioti il trascritto viene subito tradotto in proteina …

… nel nucleo delle cellule eucariotiche invece avviene un complicato processo di MATURAZIONE prima che il trascritto venga esportato nel citoplasma e tradotto.

Dal nucleo al citoplasma pori nucleari linfocita visto al M.E. dopo criofrattura Dal nucleo dove avviene la trascrizione, gli RNA messaggeri maturi passano attraverso i pori nucleari nel citoplasma, dove vengono tradotti

Nei geni degli eucarioti le sequenze codificanti per proteine (esoni) sono interrotte da sequenze non codificanti (introni). Il trascritto primario, prima di abbandonare il nucleo, viene sottoposto ad un processo di taglio e ricucitura (splicing): gli introni vengono eliminati e gli esoni riuniti uno all’altro. La molecola di mRNA maturo che esce dal nucleo sarà costituita da una sequenza codificante continua

Splicing alternativo http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21311748 Splicing alternativo e deacetilazione degli istoni

Splicing alternativo Il fenomeno dello SPLICING alternativo negli eucarioti aumenta il potenziale espressivo del genoma. E’ la regola, non l’eccezione Mediante forme di splicing alternativo da uno stesso gene possono derivare trascritti diversi che, una volta tradotti, danno luogo a proteine diverse

Potenziale espressivo in H. sapiens In H. sapiens si stima che la percentuale di geni che subiscono splicing alternativo sia >90% (Hallegger M et al., 2010) N° geni H. sapiens : 20-25000 18-22000 geni subiscono AS Il numero medio di varianti di splicing prodotto da ciascuno di questi geni è 4 (Kim H et al., 2004) La stima del numero di proteine prodotte è di 72-88000 http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1742-4658.2009.07521.x/full http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/project/info.shtml Per sapere quante proteine si originano bisognerebbe conoscere il numero medio di varianti di splicing per questi 18000-22500 geni, che originano isoforme proteiche (un gene che subisce AS può produrre molte forme alternative di mRNA e non tutti i mRNA vengono tradotti in proteine, alcuni subiscono NMRD) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21151575 ??? http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16872759 Kim H 2004 da una stima per h. sapiens di 4 forme di splicing alternativo in media per gene (http://www.nature.com/ng/journal/v36/n9/full/ng0904-915.html)

Splicing alternativo dell’ mRNA per la tropomiosina (5 isoforme) Per TPM1 TroPoMyosin 1 in genecards sono riportate attualmente (ott 2008) 7 varianti di splicing (2 isoforme nei fibroblasti) Tropomiosina: proteina che lega l’actina (coinvolta nella contrazione muscolare) e fa parte delle proteine del citoscheletro nelle cellule non muscolari

Altre differenze fra procarioti ed eucarioti….. Nei procarioti più geni possono essere trascritti in un unico mRNA (RNA policistronico) Negli eucarioti sempre 1 mRNA = 1 gene Negli eucarioti 1mRNA 1 polipeptide a meno di splicing alternativo 5’ Cap (7 metil guanilato) e poli A stabilizzano mRNA e costituiscono segnale d’attacco ai ribosomi. Poli A coinvolto in esportazione dal nucleo Stabilizzazione mRNA Esportazione mRNA dal nucleo Stabilizzazione mRNA Legame al ribosoma

mRNA eucariotico trascrizione + splicing traduzione UnTranslated Region

Regolazione dell’espressione genica Solo alcuni geni vengono costituzionalmente trascritti (geni housekeeping: enzimi del metabolismo, RNA polimerasi, ribosomi, istoni…) Per tutti gli altri esistono molti meccanismi che permettono di regolare se, quando (meccanismi di regolazione temporali) e quanto un gene deve essere trascritto Ciò è particolarmente evidente e importante negli organismi eucarioti multicellulari dove esiste una regolazione tessuto specifica (cellule diverse producono proteine diverse) Anche nei procarioti tuttavia vi sono meccanismi di regolazione dell’espressione genica OPERONI

Hanno tutti lo stesso DNA, ma esprimono geni differenti cardiomiocita epatociti neurone This is a single cardiomyocyte isolated from the heart of a normal mouse which has been labeled with antibodies to two different proteins which are normally present in myofibrils. The alternating bands of tropomodulin (green) and alpha-actinin (red) show the dense packing of myofibril throughout the interior of the cell Hanno tutti lo stesso DNA, ma esprimono geni differenti Il pattern di geni espressi per ogni tipo cellulare è diverso

Potenziali punti di controllo dell’espressione genica In primo luogo la conformazione della cromatina condiziona la trascrizione (cromatina addensata = trascrizionalmente inattiva) EUCARIOTI

Potenziali punti di controllo dell’espressione genica Controllo trascrizionale: esercitato da interruttori molecolari Fattori di trascrizione (proteine che si legano al DNA) nel sito promotore dei singoli geni o in corrispondenza di altre sequenze regolatrici

Recettore degli androgeni (AR) Membrana cellulare Esempio di fattore di trascrizione Recettore Membrana nucleare trascrizione

Regolazione trascrizionale http://www.pikaia.eu/EasyNe2/Notizie/Le_mille_magie_delle_dita_di_zinco.aspx

Regolazione coordinata dell’espressione genica Un unico fattore di regolazione dell’espressione può controllare diversi geni. Esempio: Recettore degli Androgeni, Recettore degli Estrogeni (ER) RXRA Retinoic Acid Receptor a OXT oxytocin CRH Corticotropin-Releasing Hormone ERE Estrogen Responsive Element 5’-GGTCAnnnTGACC-3’ Questa sequenza si trova nel promotore di tutti i geni controllati da ER

Regolazione coordinata dell’espressione genica nei procarioti: operoni Operone lac Operone: insieme di geni codificanti per proteine coinvolte nello stessa via metabolica la cui espressione è regolata in modo coordinato. Oltre ai geni trascritti (in un unico RNA messaggero) contengono anche sequenze regolatrici (promotore, operatore) Operone: geni strutturali + seq regolatrici (operatore, promotore)

Potenziali punti di controllo dell’espressione genica Splicing alternativo regolato da proteine cellula-specifiche Stabilità del mRNA (l’emivita del messaggero incide sulla quantità di proteina sintetizzata) Spesso in 3’ UTR ci sono sequenze specifiche per la stabilità del messaggero Spesso in 3’ UTR ci sono sequenze specifiche per la stabilità del messaggero (vedi alfa e beta globine) Inizio della traduzione Può essere bloccata da proteine regolatrici

Esempio di regolazione temporale dell’espressione: i geni codificanti per le globine Globina+eme Tetramero Quattro subunità http://www.pikaia.eu/EasyNe2/Notizie/Mammut_ed_elefanti_quando_l_emoglobina_fa_la_differenza.aspx

Le emoglobine umane 22 22 2 b2 (2 d2) Emoglobina embrionale Emoglobina fetale Emoglobina adulta e Hb fetale> affinità per ossigeno di Hb adulta: a livello placentare il sangue materno cede ossigeno al sangue fetale Durante lo sviluppo differenti geni per la globina vengono espressi in tempi diversi

Famiglia dei geni a e b globinici: la stretta vicinanza e l’ordine di sequenza facilitano la coordinazione temporale della loro espressione durante lo sviluppo Geni identici I due geni alfa sono identici (vedi genecards). I due geni gamma differiscono per il residuo 136 (Gly o Ala). HbA2 (alfa2 delta2) costituisce il 3% dell’emoglobina adulta funzione? LCR Locus Control Region (enhancer) LCR http://www.med.ufl.edu/IDP/BMB/bmbfacultypages/jbungert.html Differiscono per aa 136 (Gly-Ala)

Geni globinici: un’unica regione di controllo -LCR- regola l’attivazione o l’inattivazione dei singoli geni