Codice genetico, traduzione, sintesi proteica http://www.pesolelab.it/sections/05_Courses/02_AA2005-2006/01_BioMol/01_BMBari/bm2.46-89.pdf

TRADUZIONE: sintesi di un polipeptide sulla base dell’informazione genetica contenuta in una molecola di mRNA Si attua un cambio di linguaggio: da polinucleotidico a polipeptidico

Dobbiamo passare da un “alfabeto” a 4 lettere a uno a 20 lettere Codice genetico 4 basi (A,C,G,U) 20 aa Dobbiamo passare da un “alfabeto” a 4 lettere a uno a 20 lettere Codice a 1 lettera (41 combinazioni) 4 aa Codice a 2 lettere (42 combinazioni) 16 aa Codice a 3 lettere (43 combinazioni) 64 aa

Codice genetico mRNA codone Il codice è a triplette: 3 nucleotidi 1 aminoacido traduzione 1 tripletta = 1 codone Met Val Arg Tyr

Codice genetico Marshall Niremberg decodifica la prima tripletta UUU = Phe (fenilalanina) (traduzione in vitro di un poli U) 1966 la decodificazione è completata 43 possibili combinazioni: 64 codoni, di cui 61 sono codificanti e 3 sono codoni di STOP Traduzione di polimeri sintetici di RNA a tre nucleotidi ha permesso di decifrare tutto il codice Come fa un mRNA sintetico senza sequenze di riconoscimento a legare il ribosoma? Si usa mRNA in eccesso. 64 sono i codoni totali, 3 sono gli STOP, quindi 1 codone ogni 20 per caso è uno STOP in regioni non coding. 48Mb coding (l’ 1.5% di 3x109 bp)/ 24000 geni = 2000bp lunghezza media di un gene; 600aa lunghezza media di una proteina. Analizzando la sequenza di una regione di DNA posso capire se è codificante: - AUG seguito da un ORF abbastanza lungo (>20 triplette), poi STOP - Nel caso di procarioti è ininterrotto, nel caso di eucarioti si susseguono brevi ORF seguiti da ampie regioni (introni sono lunghi dieci volte gli esoni) in cui gli STOP codon si susseguono con frequenza di circa uno ogni venti

Aminoacidi e codoni 20 sono gli aminoacidi che formano le proteine 61 sono le triplette o “codoni” codificanti del codice genetico universale il codice genetico è “degenerato” (ridondante): più triplette codificano per uno stesso aa ma non è mai ambiguo (una tripletta codifica per un solo aa)

Degenerazione: UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, CUG codifica Leu Accenno a implicazioni della degenerazione sull’effetto fenotipico delle mutazioni che cadono in terza base Degenerazione: UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, CUG codifica Leu NON ambiguità: UUA è solo Leu, AAA è solo Lys

Il codice genetico è universale Il codice di traduzione è lo stesso per tutti gli organismi viventi AAA Lys

Un gene umano clonato in E. coli viene tradotto correttamente Plasmide Vettore d’espressione Minigene (no introni) Universalità del codice: un gene umano clonato in coli viene tradotto correttamente (minigene e no modificazioni post-traduzionali della proteina) http://publications.nigms.nih.gov/thenewgenetics/chapter2.html

Nel processo di TRADUZIONE sono coinvolti: mRNA (RNA messaggero) ribosomi (rRNA + proteine) tRNA (RNA di trasferimento)

mRNA Funzione UTR (UnTranslated Region): regolazione espressione genica post-trascrizionale Trasporto mRNA nucleo-citoplasma Efficienza traduzione Stabilità messaggero Mignone F (2005) NAR vol33

I ribosomi Sono complessi ribonucleoproteici (proteine + rRNA) in cui avviene la sintesi proteica e sono strutturati in due subunità Tra le due subunità si inseriscono gli RNA messaggeri (mRNA) per essere tradotti

La lettura del codone su mRNA è affidata al tRNA, che funge da adattatore Ala

Struttura tridimensionale del tRNA

La aminoacil-tRNA sintetasi lega l’aminoacido al corrispondente tRNA. Le cellule contengono 20 differenti aminoacil-tRNA sintetasi, una per ogni aa. Phe Phe AAA AAA La aminoacil-tRNA sintetasi lega tutti i tRNA per un determinato aa Phe legata a tRNA 5’-AAA-3’ e 5’-GAA-3’ (isoaccettori) Phe Phe AAA

Specificità della aminoacil tRNA sintetasi codoni His CAU CAC anticodoni His GUA GUG Esistono 2 tRNA per l’His Carica tutti i tRNA corrispondenti ad un solo aa http://www.soc-bdr.org/rds/authors/unit_tables_conversions_and_genetic_dictionaries/e5202/index_en.html Sito attivo dell’enzima Ogni aminoacil-tRNA sintetasi lega un particolare aa a tutti i tRNA corrispondenti a quell’aa (tRNA isoaccettori)

Aminoacidi e codoni 20 sono gli aminoacidi che formano le proteine 61 sono le triplette o “codoni” del codice genetico universale esistono tanti tRNA quanti sono i codoni? GCA GCC GCU GCG codoni Alanina 4 tRNA con anticodoni diversi per Ala?

l’anticodone IGC è in grado di leggere tre dei 4 codoni per Ala (i tRNA sono più numerosi dei rispettivi aa). In effetti l’inosina non riconosce la G. http://en.wikipedia.org/wiki/Wobble_base_pair The four main wobble base pairs are guanine-uracil, inosine-uracil, inosine-adenine, and inosine-cytosine (G-U, I-U, I-A and I-C). Inosina (modificazione di adenosina dopo sintesi di tRNA) è molto tollerante e l’anticodone IGC è in grado di leggere tre dei 4 codoni per Ala L’ultimo codone (GCG) sarà letto da un tRNA diverso

Aminoacidi e codoni Esistono 61 codoni codificanti aa. Se ciascuna molecola di tRNA si appaiasse con il codone dell’mRNA utilizzando le regole dell’appaiamento canonico tra basi complementari, sarebbero necessari 61 tipi di tRNA. Poiché la maggior parte degli organismi ha < 45 tipi di tRNA (48 nell’uomo, 31 nei batteri), questo significa che alcuni tRNA sono in grado di appaiarsi con più di un codone. http://en.wikipedia.org/wiki/Wobble_base_pair

Teria del vacillamento (wobbling) Nel 1966 Crick propose l’ipotesi del vacillamento, per cui la base in 5’ dell’anticodone (la prima), che si appaia con quella in 3’ del codone (la terza) non è sottoposta alle strette regole della complementarietà. Ciò permette un appaiamento meno preciso, vacillante. http://en.wikipedia.org/wiki/Wobble_base_pair As an example, yeast tRNAPhe has the anticodon 5'-GmAA-3' and can recognize the codons 5'-UUC-3' and 5'-UUU-3'..[

Aminoacidi e codoni 61 codoni 48 tRNA 20 aa Wobbling tRNA isoaccettori 1 tRNA legge codoni diversi tRNA isoaccettori Uno stesso aa può legarsi a tRNA diversi Il wobbling spiega perché i codoni sono 64 e i tRNA 48 L’esistenza dei tRNA isoaccettori spiega perché i tRNA sono 48 e gli aa 20 (lo stesso aa può legare diversi tRNA)

I codoni: UAA, UAG, UGA sono detti codoni di terminazione o codoni nonsenso perché non vengono riconosciuti da nessun anticodone complementare: Sono segnali di terminazione della traduzione

Traduzione 1. Inizio È il 5’ CAP a fare da segnale per l’attacco della subunità minore negli eucarioti. Il riconoscimento di sequenze sul messaggero della subunità minore è mediato da rRNA. http://www.bioygeo.info/pdf/Traduccion.pdf La subunità minore riconosce l’estremità 5’ del mRNA e scorre finchè trova AUG = codone di inizio. Richiama quindi met-tRNA + subunità maggiore

Traduzione 2. Allungamento 5’ 3’ 5’ 5’ P A 3’ 5’ P Peptidil tRNA, Aminoacil tRNA tRNA ricaricati dalle aminoacil-tRNA transferasi A 3’ 3’ Il ribosoma scorre in direzione 5’3’, i codoni vengono decifrati via via nel sito A, mentre al sito P il nuovo polipeptide cresce

L’attività peptidil transferasica della subunità maggiore del ribosoma è dovuta al rRNA Ribozima: RNA con attività catalitica

Traduzione 3. Terminazione P A Fattore di Rilascio Si lega al codone di STOP idrolizza il legame tra il polipeptide e il tRNA e promuove la dissociazione delle subunità del ribosoma Quando il ribosoma incontra un codone UAA o UAG o UGA non vi è nessun tRNA (anticodone) capace di decifrarlo: il polipeptide nascente si stacca dal sito P.

http://student. ccbcmd http://student.ccbcmd.edu/~gkaiser/biotutorials/protsyn/images/translat.gif

Molti ribosomi possono tradurre una stessa molecola di mRNA contemporaneamente formando un poliribosoma (o polisoma). In questo modo è possibile produrre molti polipeptidi in contemporanea a partire da una molecola di mRNA

Nella cellula eucariotica gli mRNA maturi che escono dal nucleo possono essere: A) tradotti da ribosomi liberi nel citoplasma  proteine per uso interno B) da ribosomi associati al RER (reticolo endoplasmatico rugoso) proteine che verranno secrete B A

Reticolo endoplasmatico e Golgi RER Sintesi proteica REL

Le proteine destinate alla secrezione vengono sintetizzate inizialmente dai ribosomi liberi nel citosol Queste proteine possiedono una una breve sequenza leader (c.a. 25 aa) all’inizio del polipeptide, che viene riconosciuta da un complesso proteico che si trova sulla superficie del reticolo Il ribosoma associato all'mRNA viene agganciato al RE, dove finisce di tradurre la proteina, la quale viene trasferita direttamente nel lume del reticolo

Una volta sintetizzate le catene polipeptidiche subiscono varie modificazioni post-traduzionali mediante le quali si trasformano in proteine funzionanti

Modificazioni post-traduzionali Es: l’insulina viene sintetizzata sul RER Dopo traduzione subisce modificazioni nel RER e nel Golgi proteolisi proteolisi Ponti disolfuro