Corso elettivo “Farmaci, integratori e doping” Facoltà di Scienze Motorie Università degli Studi di Verona Corso elettivo “Farmaci, integratori e doping” Lezioni 3 e 4: Le sostanze dopanti -1- Docenti: C. Chiamulera, G. Fumagalli, R. Leone

Le sostanze “proibite”

Sostanze la cui assunzione è proibita sia in competizione che fuori -1- S1. Agenti anabolizzanti 1. Steroidi androgeni anabolizzanti (AAS) a) AAS esogeni (es. boldenone, nandrolone, stanazolo, THG, ecc.) e altre sostanze con struttura chimica o effetto biologico similare b) AAS endogeni (es. testosterone, DHEA, ecc.) e metaboliti 2. Altri agenti anabolizzanti clenbuterolo, tibolone, zeranolo, zilpaterolo S2. Ormoni e sostanze correlate Eritropoietina (EPO), Ormone della crescita (hGH), Insulin-like Growth Factors (es. IGF-1), Mechano Growth Factors (MGFs), Gonadotropine (LH, hCG) proibite solo nei maschi, Insulina, Corticotropine e altre sostanze con struttura chimica o effetto biologico similare S3. Agonisti beta-2 Tutti proibiti: il loro uso richiede esenzione terapeutica. Salbutamolo*, formoterolo, salmeterolo e terbutalina, per via inalatoria per l’asma/ broncocostrizione indotte da esercizio, esenzione terapeutica abbreviata *Concentrazioni urinarie >1000 ng/ml sono considerate doping anche con l’esenzione

Sostanze la cui assunzione è proibita sia in competizione che fuori -2- S4. Agenti con attività anti-estrogenica 1. Inibitori delle aromatasi anastrozolo, letrozolo, aminoglutetimide, esemestano, formestano, testolattone 2. Modulatori selettivi dei recettori degli estrogeni (SERMs) raloxifene, tamoxifene, toremifene 3. Altre sostanze anti-estrogeniche clomifene, ciclofenil, fulvestrant S5. Diuretici e altri agenti mascheranti Diuretici*, epitestosterone, probenecid, inibitori alfa-reduttasi (es. finasteride), plasma expander (es. albumina, destrano) *L’esenzione terapeutica non è valida se le urine dell’atleta contengono un diuretico in associazione con una sostanza proibita (anche livelli sotto-soglia)

Metodi proibiti sia in gara che fuori M1 Aumento del trasporto di ossigeno a) doping ematico: sangue autologo, omologo o eterologo, prodotti con globuli rossi di qualsiasi origine b) sostanze che aumentano artificialmente la cattura, il trasporto o il rilascio di ossigeno: es. sostanze chimiche perfluorate, efaproxiral (RSR13) o prodotti con emoglobina modificata M2 Manipolazioni chimiche e fisiche Uso di metodi che tentano di alterare i campioni raccolti per i test antidoping (es. cateterismi, sostituzione urine). Infusioni e.v. sono proibite, tranne che per legittimi trattamenti medici acuti M3 Doping genetico Uso non terapeutico di cellule, geni, elementi genetici o la modulazione dell’espressione genica che hanno la capacità di aumentare la performance atletica

Sostanze la cui assunzione è proibita in occasione delle competizioni S6. Stimolanti Amfetamine, cocaina, efedrina*, metilefedrina*, metilfenidato, modafinil, pemolina, selegilina, sibutramina, stricnina, ecc., e altre sostanze con struttura chimica o effetto farmacologico similare (*concentrazioni urinarie >10mcg/ml) S7. Narcotici Buprenorfina, destromoramide, eroina, fentanile e derivati, idromorfone, metadone, morfina, ossicodone, ossimorfone, pentazocina, petidina S8. Cannabinoidi (es. hashish e marijuana) S9. Glucocorticosteroidi Proibiti per via orale, rettale, e.v. o i.m. a meno di esenzione terapeutica. Per altre vie (es. inalatoria, intra-articolare, ecc.) esenzione terapeutica abbreviata. Preparazioni topiche (dermatologiche, oftalmiche, ecc.) non proibite

Sostanze proibite in particolari discipline sportive P1 Alcool*: aeronautica (>0.2 g/L), automobilismo (>0.1 g/L), arco (>0.1 g/L), bocce (>0.1 g/L), karate (>0.1 g/L), pentatlon moderno per discipline tiro (>0.1 g/L), motociclismo (>0.1 g/L), motonautica (>0.3 g/L) La presenza dell’alcool viene determinata mediante analisi dell’espirato e/o del sangue. Come paragone si ricorda che in Italia il limite legale per la guida è di 0.5 g/L. P2 Beta-bloccanti* (es. atenololo, labetalolo, metoprololo, nadololo, sotalolo, timololo, ecc.) in diversi sport (es. automobilismo, arco**, bocce, biliardo, bridge, curling, ginnastica, motociclismo, pentatlon moderno, tiro al bersaglio**, sci (salti, snowboard acrobatico), wrestling) *solo in competizione, **anche fuori competizione

FARMACI CON SOSTANZE DOPANTI Le confezioni di farmaci, contenenti sostanze vietate per doping, devono recare un apposito contrassegno sull’involucro e sul foglietto illustrativo D.M. 24 settembre 2003 L’etichettatura dell’imballaggio esterno delle confezioni di tali medicinali deve includere il seguente pittogramma DOPING

Meccanismi d’azione e reazioni avverse delle principali sostanze dopanti

L’effetto placebo Effetto dell’allenamento nel sollevamento pesi Effetto dell’allenamento + placebo* nel sollevamento pesi Left graph—2% strength increase of trained weightlifters after 7 weeks Right graph—10% strength increase of trained weightlifter after being told they were taking Dianabol but actually taking placebo *Gli atleti pensavano di assumere Dianabol Ariel & Savill, MSSE, 1972

Steroidi Androgeni Anabolizzanti (AAS) Ormoni maschili endogeni (es. testosterone) Hanno effetti anabolizzanti cioè aumentano la massa muscolare, attraverso regolazione genica e aumento della sintesi proteica del tessuto muscolare. Inibiscono anche la disgregazione proteica Derivati esogeni (con struttura chimica simile al testosterone, es. nandrolone, danazolo, THG, ecc.) Con questi farmaci si è cercato di massimizzare gli effetti anabolizzanti del testosterone minimizzando allo stesso tempo gli effetti androgenici. Impresa non riuscita

- struttura tetraciclica fondamentale degli steroidi - HO CH3 H colesterolo

Ormoni steroidei propriamente detti

Ghiandola pituitaria Anteriore “adenoipofisi” Sella Turcica Posteriore “neuroipofisi” Ciascuna delle due parti ha un ruolo distinto nella regolazione ormonale

Produzione del testosterone Ipotalamo (-) GnRH ipofisi ant. (-) S FSH LH (-) Cellule del Sertoli Inibina testicolo ICSH= ormone stimolante cellule interstiziali del testicolo= LH L S L Cellule di Leydig Proteine leganti gli androgeni Testosterone (mediamente nell’uomo 8 mg/die 90-95 % testicolo 5-10% surrene) Sperma

Proteine leganti gli ormoni Sia androgeni che estrogeni si legano alle proteine plasmatiche; solo il 2% degli ormoni circolanti non sono legati: tale quota è quella biologicamente attiva. L’elevato legame prolunga l’emivita degli ormoni Albumine: non specifiche; bassa affinità; (58% legame) Gamma globuline: globuline leganti gli ormoni sessuali (SHBG); specifiche; alta affinità; (40% legame)

Biosintesi degli Steroidi Androgeni Anabolizzanti Colesterolo StAR PBR P450scc/Adx/AdR Pregnenolone 17a-hydroxylase 17, 20-lyase CYP17 CPR (b5) 3HSD I & II aromatasi DHEA (Deidropiandrosterone) Androstenedione Estrone 17HSDIII 17HSDV 17HSDII 17HSDII 17HSDI aromatasi Testosterone Estradiolo (CYP19) 5-Reduttasi I & II 3aHSD Diidrotestosterone Androstanediolo

Meccanismo d’azione del testosterone Diffonde nelle cellule target Metabolizzato a diidrotestosterone Si lega a recettori citoplasmatici Il complesso attivo trasloca nel nucleo legandosi a livello del DNA in regioni promotrici (siti di fattori di trascrizione) e altera la trascrizione genetica

Segnali ormonali t

Schema semplificato del meccanismo d’azione ormonale CELLULA BERSAGLIO Ormone Nucleo H/R DNA recettore Gln Pro Gly DNA Ormone Domini leganti trascrizione Complesso ormone recettore

TESTOSTERONE Diidrotestosterone Estradiolo Recettore androgeni (NR3A) 5-alfa reduttasi CYP19 (aromatasi) Diidrotestosterone Estradiolo Recettore androgeni (NR3A) Recettore androgeni (NR3A) Recettore estrogeni Genitali esterni Genitali interni Sviluppo durante la gestazione Muscolo scheletrico Aumento massa e forza durante la pubertà Eritropoiesi ? Osso Differenziamento nella gestazione Maturazione durante la pubertà Patologie prostatiche Follicoli piliferi Incrementata crescita durante la pubertà Osso Chiusura epifisi, aumentata densità ? Libido

Organi bersaglio ed effetti fisiologici del testosterone e dei suoi metaboliti SNC ( libido, benessere, aggressività) Ipotalamo/Pituitaria ( GnRH, LH, FSH;  GH) Laringe (abbassamento voce) Petto (  dimensione) Fegato ( SHBG, HDL) Rene ( eritropoietina, ritenzione idrosalina) Genitali ( sviluppo, spermatogenesi, funzione erettile) Cute ( peli, produzione di sebo con conseguente acne) Ossa ( densità ossea) Muscolo ( massa magra, forza) Tessuto adiposo ( lipolisi,  grasso addominale) Sangue ( ematocrito) Sistema immunitario ( produzione auto-anticorpi) Prostata ( dimensione) ICSH= ormone stimolante le cellule interstiziali del testicolo SHBG: globulina che lega gli ormoni sessuali (testosterone 95% legato Mooradian AD, Morley JE, Korenman SG. Biological actions of androgens. Endocrine Reviews 1987;8:1-28.

Raggruppamento azioni farmacologiche Azioni morfogeniche: irreversibili; si verificano durante l’embriogenesi Azioni stimolatorie: pubertà (peli, corde vocali, ossa) Azioni di mantenimento: reversibili; comportamento, libido, funzione riproduttiva Altre azioni: diminuzione tessuto linfoide; stimolazione eritropoiesi.

Raggruppamento azioni farmacologiche Effetti virilizzanti: regolazione gonadotropine; spermatogenesi; sviluppo sessuale Effetti anabolici proteici: incremento densità ossea, massa muscolare, globuli rossi

Usi clinici Terapia sostitutiva Ipogonadismo prepuberale: congenito e acquisito; terapia per 2-3 anni fino alla pubertà; dosi basse di mantenimento postpuberale: disfunzione testicolare primaria; secondario alla distruzione dell’adenoipofisi Invecchiamento e impotenza

Usi clinici Tumore mammella; endometriosi uso limitato a causa degli effetti virilizzanti Azione anabolica proteica: aumentato uptake aminoacidi; incremento RNA polimerasi nel muscolo scheletrico; antagonismo delle azioni dei glucocorticoidi; utilizzato per persone di bassa statura (19-nortestosterone)

Specialità medicinali, contenenti steroidi anabolizzanti, per uso terapeutico in Italia Clobestol: Alfatrofodermin®, Trofodermin® DHEA: Gynodian depot® Nandrolone: Deca-Durabolin®, Dynabolon® Mesterolone: Proviron® Ossandrolone: Oxandrolone® Testosterone: Andriol®, Androderm®, Androgel®, Facovit®, TestoEnant®, Testogel®, Testovis®, Testoviron®, Sustanon®

AAS e doping

Steroidi anabolizzanti di uso comune Testosterone* Stanazolo Danazolo Nandrolone Diidrotestosterone (DHT) Deidropiandrosterone (DHEA) Androstenedione Metandienone Tetraidrogestrinone (THG) Ecc. ecc. Picture of C.J. Hunter, American shot putter, who testing positive 4X during summer of 2000 for nandrolone *In giallo gli ormoni naturali C.J. Hunter: positivo per nandrolone (2000)

Atleti come promotori del doping I produttori dichiaravano che l’androstenedione è un “proormone” che può aiutare a costruire i muscoli La sua popolarità iniziò nel 1998 “grazie” a Mark McGwire, uno dei più famosi giocatori di baseball americani, che ne promuoveva l’uso “Well, I didn't endorse it. I didn't promote it. It's just something that helped me through my workouts. Period. That's it. Everybody takes supplements when they work out. You need to.” -Mark McGwire on Androstene, ESPN Magazine May 17, 1999 Disponibile come prodotto OTC sia negli USA che in UK

Tetraidrogestrinone (THG) Il tetraidrogestrinone (THG) è uno steroide anabolizzante specificatamente sviluppato come sostanza per aumentare la performance fisica e per cercare di evitare la sua individuazione nei test antidoping (Nature 2003; 425:752) Atleti del baseball negli USA, quali Barry Bonds, Jason Giambi e Gary Sheffield, hanno testimoniato nel corso di un processo contro la Bay Area Laboratory Co-Operative (BALCO) Negli USA si è svolta una vera e proprio guerra prima di mettere al bando questa sostanza, particolarmente utilizzata e non proibita nel baseball (ora lo è) Il caso del THG evidenzia la continua necessità di migliorare i metodi per la detenzione delle sostanze dopanti Per la prima volta il THG è stato testato alle Olimpiadi di Atene

Efficacia del tetraidrogestrinone (Labrie F et al Efficacia del tetraidrogestrinone (Labrie F et al. J Endocrinol 2005; 184:427)

Modalità di assunzione degli AAS come doping Via somministrazione: orale o parenterale Ciclica: tipicamente 6-8 settimane con uguale intervallo libero A dosi (10-40 volte quelle terapeutiche) crescenti e poi decrescenti (regime piramidale) Stacking: uso contemporaneo di più anabolizzanti (tipicamente uno per os e uno iniettivo) per evitare la tolleranza a un particolare steroide Sollevatori di peso e culturisti arrivano ad utilizzare dosi fino a 100 volte superiori a quelle terapeutiche Spesso si fa seguire agli steroidi anabolizzanti la gonodotropina corionica umana (hCG) per stimolare la produzione di testosterone endogeno soppresso dall’assunzione cronica degli steroidi L’ aumento della forza muscolare da AAS è potenziato da adeguati protocolli di allenamento

Gli AAS come doping funzionano! Aumentano la forza e la massa muscolare. Aumentano l’aggressività, la resistenza agli allenamenti e il recupero dopo carichi di lavoro intensi I giovani e le donne: risentono maggiormente dell’effetto anabolizzante degli steroidi in termini di performance, ma sono anche coloro che hanno il maggior rischio di effetti collaterali

Caratteristiche dello studio di Bhasin S. et al. (NEJM 1996) Studio randomizzato in doppio cieco su 43 soggetti Quattro bracci: 1) Placebo 2) Testosterone 3) Esercizio fisico + placebo 4) Esercizio fisico + testosterone Dosaggio di testosterone: 600 mg/settimana per 10 settimane Misurazione massa muscolare con Risonanza Magnetica Misurazione della forza muscolare con esercizi alla panca e allo squatting Tutte le misurazioni prima e dopo il trattamento (placebo o testosterone)

Bhasin et al NEJM 335:1-7 (1996)

“Occhio” ai numeri No Exercise + Exercise Bhasin et al NEJM 335:1-7 (1996)

Relazione dose-risposta degli steroidi anabolizzanti

Caratteristiche dello studio di Bashin S. et al Caratteristiche dello studio di Bashin S. et al. (Am J Physiol Endocrinol Metab 2001) Studio randomizzato in doppio cieco su 61 soggetti (18-35 anni) trattati con diverse dosi di testosterone Cinque gruppi: 1) 25 mg/sett. 2) 50 mg/sett. 3) 125 mg/sett. 4) 300 mg/sett. 5) 600 mg/sett. Durata trattamento 20 settimane Misurazioni: ad inizio e alla 20a settimana. Il volume della coscia misurato con RM. La forza misurata con un esercizio allo squatting

Dose settimanale testosterone (mg) 125 25 50 300 600 Bashin S et al. Am J Physiol Endocrinol Metab 2001; 281:E1172-1181

Dose settimanale testosterone (mg) 125 25 50 300 600 Bashin S et al. Am J Physiol Endocrinol Metab 2001; 281:E1172-1181

Dose settimanale testosterone (mg) 25 50 125 300 600 Bashin S et al. Am J Physiol Endocrinol Metab 2001; 281:E1172-1181 25

Dose settimanale testosterone (mg) 25 50 125 300 600 Dose settimanale testosterone (mg) Bashin S et al. Am J Physiol Endocrinol Metab 2001; 281:E1172-1181

Dose settimanale testosterone (mg) 25 50 125 300 600 Dose settimanale testosterone (mg) Bashin S et al. Am J Physiol Endocrinol Metab 2001; 281:E1172-1181

Change in Insulin-like Growth Factor 1 (ng/ml) 25 50 125 300 600 Dose settimanale testosterone (mg) Change in Insulin-like Growth Factor 1 (ng/ml) Bashin S et al. Am J Physiol Endocrinol Metab 2001; 281:E1172-1181

Curve Dose-Risposta AAS Massa muscolare Dose AAS Ipogonica Eugonadica Soprafisiologica

effetto sul lancio del peso in un atleta donna della DDR 17 18 19 20 Distance (meters) Turinabol orale: effetto sul lancio del peso in un atleta donna della DDR

Non sempre funzionano: effetti del DHEA e androstenedione dopo 12 settimane di allenamento Wallace et al., MSSE, 1999

Tecniche antidoping per AAS Steroidi sintetici: individuabili con gas-cromatografia o spettrofotometria di massa HPLC-MS di metaboliti coniugati Per indagare la somministrazione esogena di testosterone viene usato il rapporto testosterone/epitestosterone nelle urine Un T/E > 4 è considerato sospetto (normale < 2) Altro rapporto indicativo: T/LH > 30 Rapporto di 5a/non-5a C19 steroidi

Antidoping AAS Strategie per evitare di essere individuati Utilizzo di sostanze difficili da individuare Periodi di astinenza AAS sintetici iniettabili individuali fino ad oltre 6 mesi Diuretici per diluire le urine Uso di ketoconazolo: riduce l’eliminazione del testosterone endogeno fornendo così un rapporto T/E “normale” Uso di finasteride per diminuire la formazione dei metaboliti 5a-ridotti Assunzione di epitestosterone Contaminanti batterici Alterare i campioni (sostituzione, ecc.)

Individuare il diidrotestosterone (DHT) Problemi: breve emivita DHT endogeno Isotope Ratio Mass Spectrometry 13C contenuto di DHT endogeno vs esogeno d13C% < -29 suggerisce una fonte esogena Ratio of 5a:non-5a C19 steroidi 5a-/5b- Androsterone-3a,17b-dioli Sviluppato dalla Mitsubishi Chemical Co. Utilizzato nei campionati di nuoto asiatici (1994) per individuare ricorso al doping nelle atlete cinesi

DHT: nuotatrici cinesi Atleta Limite superiore normale: 5a/5b-A DHTcorr 12.13 1.88 2.20 2.72 5aA/Etio DHT/EpiT

Reazioni avverse degli AAS Cardiovascolari Cardiomiopatia, ictus, infarto miocardio Fegato Danno epatocellulare, colestasi Tumori Dislipidemia Aumento LDL, diminuzione HDL Attivazione lipasi epatiche

AAS: reazioni avverse a livello del SNC Euforia, mania, paranoia Aggressività, ira, tendenza all’omicidio, abusi sessuali Depressione, tendenza al suicidio durante l’astinenza

Sindrome d’astinenza da AAS (modello bifasico) Dipendenza dagli AAS Dipendenza psicologica comune Dipendenza fisica controversa Sindrome d’astinenza da AAS (modello bifasico) Prima fase (1-2 settimane) agitazione, instabilità vasomotoria Può essere necessaria ospedalizzazione Seconda fase (mesi) depressione, debolezza Esacerbazione sintomatologia da stato ipogonadale

Altre reazioni avverse degli AAS Bambini Fusione piastra epifisaria Arresto della crescita Infezioni Ascessi/cellulite, HIV, epatiti virali Rotture tendini (superallenamento?) Edemi per ritenzione idrica Policitemia

Reazioni avverse degli AAS specifiche per l’uomo Infertilità Incidenza incrementata durante l’uso Reversibile alla sospensione e con uso di gonadotropine corioniche Ginecomastia Si può utilizzare il testolattone (derivato del testosterone Iperplasia prostatica, tumori prostata

Reazioni avverse degli AAS specifiche per la donna Amenorrea Atrofia del seno Irsutismo Ispessimento del clitoride Abbassamento della voce Effetti spesso irreversibili

Abuso di steroidi anabolizzanti Polifarmacia per mascherare gli effetti avversi Ginecomastia Acne Atrofia testicolare Edemi Aumento peso Tamoxifene Testolattone Tretinoina o antibiotici hCG Diuretici Tiroxina

Altri anabolizzanti: es. il tibolone Il tibolone (Livial® ) abbina un’attività estrogenica e progestinica con una debole attività androgenica Usato per la terapia dei sintomi vasomotori post menopausali e per la profilassi della osteoporosi

Ormone della crescita umano (hGH) L’Underground Steroid handbook” (rivista californiana) già conteneva le informazioni sul hGH prima che se ne parlasse nella letteratura scientifica. L’uso del hGH è iniziato con hGH estrattivo, ancora oggi esistono traffici al mercato nero di ipofisi umane. Dal 1996 è prodotto mediante biotecnologia genetica L’approvvigionamento di GH umano ricombinante (rhGH) deriva da furti, ricette false, vendita da genitori di bambini affetti da deficit dell’ormone della crescita. Azione additiva con gli AAS

Ormone della crescita umano (hGH) Mentre l’ormone naturale è costituito da forme diverse fra loro in termini di PM, il GH sintetico viene prodotto in un’unica forma, corrispondente alla forma naturale principale, di PM 22 kDa. La secrezione pulsatile, la breve emivita, le variazioni interindividuali e il fatto che il GH aumenti fisiologicamente e in maniera marcata, fino a 100 volte rispetto ai livelli basali, durante l’attività fisica rendono molto difficile l’individuazione di questa forma di doping. L’uso del GH in ambito sportivo si è diffuso a partire dai primi anni ’90, malgrado l’ormone fosse stato inserito nella lista delle sostanze proibite già a partire dal 1989. Non vi sono dati epidemiologici precisi, anche per la difficoltà di rilevazione della presenza di GH non naturale. L’abuso di GH sembra piuttosto diffuso, anche considerando atleti non di elite. Uno studio americano dei primi anni ’90 ha stimato che il 5% degli studenti maschi delle scuole superiori utilizzava o aveva fatto uso improprio di GH, malgrado i costi elevati e le difficoltà di approvvigionamento [Rickert et al. Human Growth Hormone: a new substance of abuse among adolescents? Clin Ped 1992;31:723-6]

Il GH è prodotto dall’adenoipofisi Il GH stimola la produzione di IGF-1 (Insulin-like Growth Factor) che deve il suo nome alle analogie strutturali con l’insulina

I recettori accoppiati alle tirosin-chinasi I recettori non hanno di per se stessi attività chinasi, ma il complesso legando-recettore attiva le tiron-chinasi che fosforilizzano dei substrati cellulari funzionanti come secondi messageri

Recettore dell’Ormone della Crescita Extracellulare Ormone della crescita Dominio extracellulare del recettore del GH Legandosi al recettore porta alla dimerizzazione delle subunità recettoriali per cross fosforilazione =O3PO- -OPO3= Intracellulare Recettore dell’Ormone della Crescita

Tyrosine Kinase Receptors Cross phosphorylation

Cell Signaling via RTK and Ras Cell signaling via RTK e RAS

Schema di funzionamento dell’ormone della crescita Il GH è un ormone polipeptidico a singola catena; GHRH stimola rilascio; Somatostatina inibisce il rilascio di GH

Effetti dell’Ormone della Crescita Stimola la crescita di tutti i tessuti del corpo capaci di crescere Stimola la produzione di IGF-1 (Insulin-like growth factor) che media molti degli effetti del GH Effetti del GH sui processi metabolici: Incrementata sintesi proteica in tutte le cellule (incremento massa magra) Diminuita utilizzazione dei carboidrati da parte delle cellule Aumentata mobilizzazione degli acidi grassi liberi ed utilizzo degli acidi grassi per produrre energia (effetto lipolitico)

Principali organi/tessuti bersaglio del GH e relativi effetti dell’ormone Organo/tessuto bersaglio Principali effetti Apparato scheletrico Differenziazione e proliferazione delle cellule cartilaginee Apposizione ossea Apparato cardiovascolare Aumento contrattilità cardiaca e frequenza cardiaca riduzione resistenze vascolari; ipertrofia miocardica Fegato Aumento glicogenolisi, neoglucogenesi, chetogenesi Tessuto adiposo Aumento della lipolisi con diminuzione grasso corporeo Muscolo Aumento della massa muscolare; aumento della forza (?) Rene Ritenzione idro-salina, con aumento della volemia Intestino Aumento assorbimento di calcio Cervello Senso benessere e di energia, capacità di concentrazione Cute Crescita dei peli Azioni ubiquitarie Insulinoresistenza; proliferazione cellulare

Specialità medicinali contenenti ormone della crescita in commercio in Italia Genotropin Kabipen Genotropin Miniquick Genotropin Humatrope Norditropin Simplexx Nutropinaq Saizen Zomacton

Modalità di esaltazione dell'azione del GH Esistono sostanze capaci di aumentare la secrezione di GH endogeno: Vasopressina Clonidina Propranololo Aminoacidi (arginina, lisina, ornitina) GHB (gamma idrossi butirrato)

Discipline sportive in cui si sospetta l’uso di hGH in base alle sue azioni

Il GH effettivamente incrementa la performance degli atleti? Perché gli atleti utilizzano rhGH? L’ormone della crescita ricombinante è una “sostanza simile alla endogena” difficile da distinguere dall’ormone naturale. Rapida eliminazione. Il GH effettivamente incrementa la performance degli atleti? Non ci sono dati che dimostrano l’efficacia Pelissier-Alicot Al., Leonetti G. Am Bio Clin 2003; 61:41-8 Non ci sono evidenze di aumento della forza muscolare in atleti in allenamento Dean H. Clin J Sport Med 2002; 12:250-3; Ehrnborg C, et al. Clin Endocrinol (Oxf). 2005; 62:449-57. Berggren A, et al. J Clin Endocrinol Metab. 2005; 90:3268-73

Funziona come sostanza dopante? La difficoltà di valutare l’efficacia del GH nel migliorare la performance fisica deriva soprattutto dalla scarsità di dati controllati e a lungo termine sugli effetti di alte dosi di GH, infatti negli studi sperimentali, per esigenze etiche, la quantità di GH somministrato e la durata del trattamento sono sempre relativamente contenuti. Si stima che alcuni atleti arrivino a somministrarsi oltre 8 mg di GH al giorno, 3-4 volte la settimana. Questa quantità è circa 20 volte superiore a quella utilizzata a scopo terapeutico dai soggetti adulti con deficit ormonale. Generalmente la quantità di GH somministrata nel doping è verosimilmente più contenuta, dell’ordine di 1,5-2 mg/die, ma comunque il sovradosaggio non è trascurabile e abitualmente questo ormone è associato all’uso di altri agenti dopanti, quali gli steroidi anabolizzanti negli sport di potenza e l’eritropoietina in quelli di resistenza. La combinazione con l’insulina permette teoricamente un effetto sinergico sul metabolismo proteico, associando l’azione di stimolo della protidosintesi propria del GH con l’inibizione del catabolismo proteico determinata dall’insulina.

Dal Corriere della Sera 25 settembre 2000 ….Rosolino, Bellutti, Idem, Trillini e Abbagnale, tutte medaglie d'oro a Sydney, ai quali nel corso di vari esami eseguiti prima delle Olimpiadi sono stati riscontrati valori anomali di GH… "E' solo una strumentalizzazione per un problema che non esiste", ecco la risposta di Antonella Bellutti, "sono dati che non hanno alcuna valenza, finalizzati solo a rovinare l'immagine degli atleti. Sono senza parole, è da una vita che faccio la lotta al doping"...

Reazioni avverse dell’ormone della crescita Edemi Artralgie, mialgie e miopatie Dolore all’articolazione mandibolare Gigantismo Acromegalia Ipotiroidismo Patologie cardiache (es. cardiomiopatia) Diabete mellito Impotenza Osteoporosi Polipi al colon

L’insulina nel doping L’inserimento dell’insulina nella lista delle sostanze proibite risale al 1998 dopo le olimpiadi invernali di Nagano: quando un medico della squadra russa chiese ai responsabili del CIO se l’uso dell’insulina in atleti non diabetici era lecito o meno. Nacque il sospetto! Da indagini successive, condotte nel Regno Unito, emerse che effettivamente l’uso dell’insulina era già diffuso in vari sport. Fra i bodybuilders, in particolare, risultò che almeno il 10% ammetteva l’assunzione di insulina. Da dati americani, ricavati dall’intervista di frequentatori di palestre che dichiaravano l’uso di steroidi anabolizzanti per via iniettiva, risultò che il 25% di questi soggetti associava agli anabolizzanti insulina, allo scopo di aumentare la massa muscolare [Rich JD et al. Insulin use by bodybuilders. JAMA 1998;278:1613]

L’insulina nel doping La maggior parte di questi soggetti riferiva di consumare bevande o cibi contenenti zuccheri subito dopo la somministrazione dell’insulina, per evitare il calo della glicemia indotto dall’insulina, e nessuno lamentava apparenti episodi di ipoglicemia. Successivamente sono stati segnalati, sempre in bodybuilder, ripetuti casi di grave coma ipoglicemico con danni neurologici, conseguenti all’assunzione di elevate quantità di insulina (fino a 320 Unità in poche ore, una quantità pari a circa 10 volte il fabbisogno giornaliero di un diabetico) [Elkin SL et al. Bodybuilders find it easy to obtain insulin to help them in training, BMJ 1997; 314:1280; Reverter JL et al. Self-induced insulin hypoglycemia in a bodybuilder. Arch Intern Med 1994; 154:225-6; Evans PJ, Lynch RM. Insulin as a drug of abuse in body building. Br J Sports Med 2003; 37:356-7]. Negli ultimi anni, la cronaca ha documentato un ampio uso di insulina anche nel ciclismo professionista.

L’insulina Proteina prodotta dalle cellule beta del pancreas Due catene (A e B), di 51 aminoacidi complessivi, legate da ponti disolfuro Gene codificante posto sul cromosoma 11 Dopo un digiuno fisiologico di 8-10 ore, come quello notturno, le concentrazioni circolanti di insulina sono di 5-15 µU/ml e nel soggetto normale la produzione giornaliera si aggira intorno a 20-25 U. Precursore dell’insulina la proinsulina

Insulin Sintesi e struttura dell’insulina Proinsulin C peptide A Chain Gli ormoni peptidici sono sintetizzati come preproormoni inattivi che includono una sequenza segnale, l’ormone e altri frammenti peptidici aggiuntivi Insulin MW 5808 Proinsulin C peptide Ca2+-dependent endopeptidases PC2 (PC3) PC3 A Chain Nobel Prizes Fredrick Banting, John Macleod 1923 Fredrick Sanger 1958 Rosalyn Yalow and Solomon Berson DOROTHY CROWFOOT HODGKIN 1964 Nobel Laureate in Chemistry1978: Human insulin cloned into E. coli by Genentech scientists. Genentech licenses , the human insulin technology to Eli Lilly. In 1982, human insulin, Humulin, becomes the first recombinant DNA drug approved by FDA. [ B Chain Fornita da Ann K. Snyder

Regolazione della secrezione di insulina Fornita da Ann K. Snyder Na+ GLUT2 K+ KIR K+ Na+ K+ Vm K+ - Ca2+ Ca2+ Pancreatic ß cell Ca2+ Ca2+ Voltage-gated Ca2+ channel Ca2+ Insulin granules

Secrezione basale dell’insulina Fornita da Ann K. Snyder Pacemaker ß cells Na+ GLUT2 K+ Signal Na+ KIR K+ K+ Vm K+ Ca2+ Ca2+ Pancreatic ß cell Ca2+ Ca2+ Voltage-gated Ca2+ channel Ca2+ Insulin granules

Secrezione insulina stimolata dal glucosio Fornita da Ann K. Snyder Glucose ß cell integrates input from various metabolites, hormones and neurotransmitters Na+ Na+ GLUT2 K+ KIR K+ K+ Na+ Glucokinase Km= 7-9 mM K+ K+ - Vm K+ ATP Ca2+ Pancreatic ß cell Ca2+ Ca2+ Voltage-gated Ca2+ channel IP3 cAMP Ca2+ Insulin granules

Rilascio insulina: livelli fisiologici Units: 1 U = 36 µg Daily secretion in humans: 40 - 50 U Basal plasma insulin: 12 µU/ml Postprandial insulin: up to 90 µU/ml Basal Meal Glucose, mg/dl 120 100 80 60 40 20 Insulin, U/ml Minutes 0 30 60 90 120 Fornita da A.K. Snyder

Recettore dell’insulina Recettori superfice cellulare: sub-unità a siti di legame dell’insulina Membrana plasmatica sub-unita b con attività tirosin kinasi Fornita da Ann K. Snyder

Attivazione del recettore dell’insulina Insulin binding to a subunit regulates b subunit activity Insulina GLUT4 PO4- autophosphorylation of b subunit IRS-1 + ATP GLUT4 IRS-1-PO4  tyr kinase activity Glucose transporter translocation to plasma membrane phosphorylation of other substrates activation of phospho- inositide 3-kinase Fornita da Ann K. Snyder

Attivazione del recettore dell’insulina Insulin binding to a subunit regulates b subunit activity Insulin GLUT4 PO4- autophosphorylation of b subunit IRS-1 + ATP e.g. GLUT expression IRS-1-PO4 MAPK + ATP MAPK-PO4 Transcriptional regulation Protein synthesis, proliferation & differentiation  tyr kinase activity phosphorylation of other substrates phosphorylation of MAP kinase Fornita da Ann K. Snyder

Insulin receptor signaling Attivazione del recettore dell’insulina Insulin receptor signaling Insulin binding to a subunit regulates b subunit activity Insulin GLUT4 PO4 autophosphorylation of b subunit IRS-1 + ATP IRS-1PO4 Glycogen deposition glycogen synthase protein phosphatase-1 phosphorylase kinase phosphorylase  + -  tyr kinase activity phosphorylation of other substrates Effect on glycogen synthesis: enzyme cascade Phosphorylated glycogen synthase is inactive Phosphorylated phosphorylase is active MAPK Þ pp90S6 kinase Þ glycogen-associated protein phosphatase-1 Þ activation of glycogen synthase inactivation of phosphorylase kinase Þ inactivation of phosphorylase phosphorylation of MAP kinase

Effetti dell’insulina Stimola Inibisce Fegato Muscolo scheletrico Tessuto adiposo sintesi glicogeno glicogenolisi sintesi trigliceridi chetogenesi gluconeogenesi utilizzo glucosio sintesi proteine degradazione proteica sintesi glicogeno glicogenolisi accumulo trigliceridi lipolisi Promuove processi anabolici Inibisce processi catabolici

L’insulina nel doping L’insulina può stimolare la formazione di glicogeno attraverso la facilitazione dell’entrata del glucosio nelle cellule in quantità superiori a quelle necessarie per il fabbisogno immediato. Poiché la performance è funzione delle scorte muscolari di glicogeno, “incrementare” queste scorte potrebbe essere di ausilio. Il mantenimento di uno stato di iperinsulinemia potrebbe quindi essere utilizzato per aumentare le concentrazioni muscolari di glicogeno prima della prestazione e accelerarne il ripristino subito dopo la prestazione. L’effetto anabolico proteico dell’insulina può essere un fenomeno biologicamente rilevante in caso di esposizione a concentrazioni sovrafisiologiche dell’ormone o di contemporanea somministrazione di un ormone che stimoli la sintesi proteica come il GH e in presenza di adeguato apporto di glucosio e aminoacidi. Attraverso questo regime è quasi certamente possibile aumentare la massa muscolare e la performance, anche perchè viene inibita la proteolisi [Sonksen PH. Insulin, growth hormone and sport. J Endocrinol. 2001;170:13-25].

L’insulina nel doping Le preparazioni di insulina disponibili nei Paesi avanzati sono prodotte mediante la tecnica del DNA ricombinante e sono caratterizzate da sequenze aminoacidiche identiche a quella dell’insulina umana o sono varianti di questa, con diverse proprietà in termini di rapidità e durata di effetto. Nei casi descritti di utilizzo di insulina a scopo dopante sono state impiegate formulazioni ad azione rapida o ultrarapida, per via sottocutanea o endovenosa. Ancora non è possibile rilevare direttamente l’abuso di insulina umana ricombinante, identica all’ormone endogeno. Tuttavia, il dosaggio contemporaneo del C-peptide, molecola secreta dal pancreas in quantità equi-molari con l’insulina ed espressione della produzione endogena di insulina, può svelare l’uso di ormone esogeno, che contiene insulina ma non C-peptide, purché il prelievo avvenga nelle ore successive alla somministrazione.

Reazioni avverse dell’insulina Ipoglicemia (fino al coma e morte, aumento rischio con l’alcol) Allergia Reazioni locali cutanee o sistemiche, rara anafilassi Lipoipertrofia Dovuta all’effetto lipogenico dell’insulina quando si utilizza la stessa area per frequenti iniezioni Lipoatrofia Dovuta alla presenza di impurità Edema da insulina transitorio e raro Tremori, sudorazione, ansia, agitazione

Altri regolatori ormonali Gonadotropine (LH, hCG) proibite solo nei maschi Dal 1987 il Comitato Olimpico Internazionale ha incluso nella lista delle sostanze proibite la Gonadotropina Corionica Umana (hCG), un ormone che, analogamente all’Ormone Luteinizzante (LH) ipofisario, é in grado di stimolare la produzione endogena di testosterone. L’hCG è una glicoproteina costituita da 237 aminoacidi, prodotta dalla placenta umana. Gli effetti biologici dell’hCG sono in gran parte simili a quelli dell’LH prodotto dall’ipofisi, ma alcuni sono invece tipici dell’ormone placentare. hCG= gonadotropina corionica

Effetti biologici dell’hCG SIMILI ALL’LH Effetto luteinizzante sulle cellule follicolari ed interstiziali ovariche Induzione dell’ovulazione in follicoli preparati dalle gonadotropine Aumento della produzione di progesterone dal corpo luteo Stimolazione delle cellule interstiziali del testicolo Stimolazione della sintesi di testosterone nel testicolo ESCLUSIVI DELL’hCG Prolungamento attività funzionale corpo luteo Incremento della sintesi steroidea placentare Azione di stimolo sulle gonadi e sui surreni fetali hCG= gonadotropina corionica

Motivi dell’uso, come doping, delle gonadotropine nei maschi 1. La somministrazione prolungata di alte dosi di androgeni determina una marcata inibizione dell’asse ipotalamo-ipofisi-testicolo. Questo effetto si traduce in una riduzione delle dimensioni dei testicoli e della loro capacità di produrre testosterone e spermatozoi. La somministrazione di hCG serve dunque a mantenere lo stimolo trofico sul testicolo e la produzione endogena di testosterone, favorendo un recupero più rapido della funzione gonadica una volta sospeso il trattamento con androgeni. 2. lo stimolo con hCG può ostacolare il riconoscimento dell’uso di androgeni esogeni nei comuni test impiegati a tale scopo. La somministrazione di hCG stimola la produzione endogena sia di testosterone che di epitetosterone, senza alterare significativamente il rapporto T/E (Cowan DA et al. J Endocrinol 1991;131:147-54). hCG= gonadotropina corionica

Motivi dell’uso, come doping, delle gonadotropine nei maschi 3. Nel maschio normale l’hCG produce un prolungato aumento, dose-dipendente, della concentrazione di testosterone attraverso la stimolazione della secrezione dell’ormone da parte delle cellule interstiziali del Leydig del testicolo. Questo effetto è stato dimostrato sia con l’ormone naturale, estratto dalle urine di donne gravide, che con hCG ricombinante. La concentrazione basale di testosterone aumenta, dopo una singola iniezione di hCG, di circa il doppio (Trinchard-Lugan I et al. Reprod Biomed Online 2002;4:106-15). Le concentrazioni di testosterone che si ottengono sono all’interno del range che sperimentalmente mostra una relazione lineare con l’aumento della massa e della forza muscolare nel maschio. La proibizione dell’uso di hCG nel maschio, in assenza di patologia specifica, appare pertanto pienamente fondata. hCG= gonadotropina corionica

Gonadotropine nelle donne Le evidenze disponibili suggeriscono che l’hCG abbia un effetto trascurabile sulle concentrazioni di testosterone nella donna (pertanto il suo uso da parte delle atlete non è considerato doping). Questo dato, insieme con le concentrazioni fisiologicamente molto più basse di questo ormone nel sesso femminile, rende più remota la possibilità che l’uso dell’hCG nella donna possa avere effetti significativi (Bhasin S et al. Am J Physiol Endocrinol Metab 2001;281:E1172-81) GH in commercio: Gonasi HP®, Pregnyl®, Profasi HP® LH in commercio: Luveris®. Inoltre vari farmaci che liberano le gonadotropine (es. buserelina, gonadorelina, goserelina, ecc.) Effetti avversi riconducibili a quelli degli steroidi anabolizzanti. Due sintomi gravi sono rappresentati dalla cefalea fastidiosissima e, sul piano psicologico, dalla depressione. hCG= gonadotropina corionica

Altri regolatori ormonali Corticotropina (ACTH) 

Altri regolatori ormonali Corticotropina (ACTH)  E’ un ormone prodotto dall’ipofisi anteriore. L’ACTH stimola la corteccia surrenale a produrre cortisolo che controlla il metabolismo glucidico e l’equilibrio idro-salino. I fattori che fisiologi-camente influenzano il rilascio di ACTH sono soprattutto tre: ritmo circadiano, stress e feed-back negativo esercitato dal cortisolo. Nella risposta all’esercizio fisico, l’attivazione del sistema ACTH-cortisolo svolge un importante ruolo di adattamento metabolico, stimolando la degradazione proteica e la trasformazione epatica degli aminoacidi gluconeogenetici in glucosio. Il cortisolo stimola anche glicogenolisi, lipolisi e chetogenesi e contrasta l’azione periferica dell’insulina, svolgendo un ruolo eminentemente catabolico, di rapida messa a disposizione per l’organismo di combustibile energetico.

Altri regolatori ormonali Corticotropina (ACTH)  Oltre a questi effetti metabolici, il sistema ha degli effetti sul sistema immunitario, su quello cardiovascolare, nonché su aspetti neuropsichici, permettendo di ridurre l’infiammazione e la percezione del dolore e conferendo una sensazione complessiva di benessere psico-fisico. L’attivazione dell’ACTH e della corteccia surrenale è tipica nelle condizioni di stress, pertanto la giustificazione nell’uso di questo ormone è quella di fornire all’atleta una maggior quota di ormone per fronteggiare lo stress.

Altri regolatori ormonali Corticotropina (ACTH)  Questi effetti sono utili nel breve termine ma assumono una connotazione negativa sul lungo termine, dato l’ostacolo ai fenomeni di riparazione, il consumo di proteine utilizzate a fini energetici, la perdita di muscolo e di massa ossea, le alterazioni metaboliche, l’aumento dei valori di pressione arteriosa e la soppressione del sistema immunitario che conseguono ad un eccesso cronico di glucocorticoidi. Specialità medicinale in commercio in Italia: Synacthen®, Cortrosyn®, Le complicazioni sono gravi, anche se rare, tenuto conto dell’azione multifocale dell’ACTH e degli ormoni surrenali: ritenzione idrica, diabete, alterazioni cutanee, riduzione delle difese immunitarie, miopatie, obesità, osteoporosi, ulcera gastroduodenale.

L’ACTH è utile come sostanza dopante? Nel mondo sportivo è generalmente diffusa l’idea che l’ACTH aumenti la performance fisica. Tuttavia la documentazione scientifica concernente questa problematica è limitatissima. Esiste un solo studio condotto nell’uomo [Soetens E et al. Psychopharmacology 1995;118:260-6]. Questo studio ha valutato l’efficacia della somministrazione di ACTH in 16 ciclisti professionisti sottoposti per un’ora ad uno sforzo ergometrico submassimale, incrementato successivamente di 10 W ogni minuto sino all’esaurimento. Come atteso è stato documentato dopo ACTH un aumento di parametri quali cortisolo, glicemia, globuli bianchi. Non è stata invece osservata alcuna modifica della performance massimale in rapporto alla somministrazione dell’ormone. Una riduzione della sensazione di affaticamento durante la performance submassimale era l’unico dato, soggettivo, riportato dagli atleti trattati rispetto ai non trattati. Gli Autori speculano che proprio la percezione psicologica potrebbe alimentare l’opinione che l’ACTH abbia proprietà ergogene.

AGENTI CON ATTIVITÀ ANTIESTROGENICA 1) Inibitori delle aromatasi, agiscono inibendo l’enzima (aromatasi) responsabile della conversione degli androgeni in estrogeni (aminoglutetimide, anastrozolo, letrozolo, exemestane) 2) Antagonisti dei recettori per gli estrogeni (raloxifene, tamoxifene, toremifene, clomifene, ciclofenile), inibendo il legame degli estrogeni con i propri recettori bloccano i loro effetti biologici

AGENTI CON ATTIVITÀ ANTIESTROGENICA Nel doping l’utilizzo di questi farmaci è molto diffuso, sia per migliorare la performance sia come strumento per ovviare ad alcuni inconvenienti della terapia con steroidi anabolizzanti. Gli antiestrogeni sono infatti in grado di incrementare i livelli di testosterone, in particolare nel maschio. Questo effetto è dovuto al fatto che il feed-back negativo esercitato dagli androgeni sulla secrezione ipofisaria delle gonadotropine è almeno in parte mediato dagli estrogeni prodotti a partire dagli androgeni stessi. Il blocco di questo effetto estrogenico si traduce quindi in un’aumentata secrezione di ormone luteinizzante (LH), che a sua volta stimola quella di testosterone da parte del testicolo. Per lo stesso meccanismo, un altro effetto di queste sostanze è quello di facilitare la ripresa della secrezione endogena di testosterone dopo un ciclo di androgeni esogeni. L’uso degli antiestrogeni insieme agli anabolizzanti è legato anche al fatto che uno degli effetti collaterali degli anabolizzanti è la comparsa di ginecomastia, dovuta alla formazione di un eccesso di estrogeni a partire dagli androgeni esogeni. Gli antiestrogeni bloccano questo fenomeno.

Reazioni Avverse Complessivamente gli antiestrogeni sono farmaci ben tollerati Aminoglutetimide: sonnolenza, insufficienza surrenalica (alte dosi) Anastrozolo, letrozolo: dolore o rigidità articolare, disturbi digestivi, eruzioni cutanee, cefalea, astenia Exemestane: vampate di calore e nausea; meno frequenti vertigini, stanchezza, eccesso di sudorazione Tamoxifene, toremifene: vampate di calore, trombosi venosa, disturbi digestivi, alterazioni della pelle, ritenzione di liquidi, alterazioni nel numero delle cellule del sangue, stanchezza Raloxifene: vampate di calore, trombosi venosa, crampi Clomifene, ciclofenile: sintomi da carenza estrogenica (vampate, ecc.), disturbi visivi, disturbi digestivi