RNA interference

phenotype RNA interference Forward genetics Reverse genetics Ricombinazione omologa in cellule embrionali staminali di topo: topi KO RNA antisenso RNA interference

Introduzione nella cellula di RNA a doppio filamento RNA interference: Introduzione nella cellula di RNA a doppio filamento induce il silenziamento del gene target flies fungi worms mammals plants Esempio di Silenziamento Genico Post Trascrizionale (PTGS): Già noto nelle piante: transgeni ad alto numero di copie e altamente trascritti inducono il silenziamento del gene endogeno Può essere considerato come un primitivo sistema di autodifesa contro RNA esogeno (virus) o RNA endogeno trascritto in modo aberrante (trasposoni) Un nuovo potente strumento di modulazione dell’espressione genica Nuove e inattese rivelazione sui meccanismi di regolazione genica

La Scoperta dell’ RNAi Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans Fire et al, 1998 In C. elegans: introduzione di dsRNA è molto più potente nell’indurre il silenziamento genico rispetto a sRNA e asRNA dsRNA corripsondenti a regioni introniche o al promotore non funzionano dsRNA microiniettato nelle gonadi induce silenziamento genico in tessuti mitotici: amplification-spreading Targeted mRNA degradation by double stranded RNA in vitro Tuschl et al, 1999 In Drosophila: Un estratto citoplasmatico di Drosophila + luciferasi mRNA esogeno + dsRNA luciferasi: silenziamento genico dsRNA guida la formazione di un complesso citoplasmatico che determina la degradazione specifica di mRNA omologo RNA interfernce is mediated by 21 and 22-nucleotide RNAs Elbashir et al, 2001 In Drosophila: dsRNA è processato a 21-22nt dsRNA con 5’P, 2nt protruding 21-22-dsRNA sono sufficienti a indurre RNAi

DICER: RNAse III ribonuclease family specifico per dsRNA Altamente conservato in flies, plants, worms e human RISC-RNA Induced Silencing Complex Endonuclease non identificata: SLICER Copurifica con ARGONAUTE e EIFC2 (elongation factor) e elicasi DICER RISC Produzione di siRNA 21-22 dsRNA, 5’ P, 2nt overhang Riconoscimento e taglio endonucleasico del mRNA target

RdRP:RNA polimerasi RNA dipendente Sid1: canale di membrana I vermi sono diversi… In C. elegans SPREADING:dsRNA microiniettato nelle gonadi causa RNAi in tessuti mitotici nel resto dell’organismo AMPLIFICATION: RNAi efficiente anche a partire da quantità minimi di dsRNA TRANSITIVE RNAi: il silenziamento genico può agire in TRANS e in CIS. Movimento 3’ -5’ dell’attività nucleasica e generazione di nuovi dsRNA RdRP:RNA polimerasi RNA dipendente Sid1: canale di membrana

Un ruolo biologico per l’RNAi? RNAi: Un primitivo sistema immunitario contro virus e retrotrasposons Inattivazione dell’RNAi causa diffetti nello sviluppo in diversi organismi Mutationi in ARGONAUTE (dsRNAbinder in RISC) causano diffetti nello sviluppo in A. thaliana, C. elegans e Drosophila microRNA piccoli (21-22nt) ssRNA scoperti in C.elegans (Lin4 and Let7: worms development) Altamente conservati nell’evoluzione Silenziamento genico a livello postraduzionale: mRNA binding-blocco sintesi proteica 21-22 nt single strand RNA processati da dsRNA precursori a 70nt (miRNA)!! Link to RNAi: DICER ko hanno alti livelli miRNA precursoridi Lin4 e Let7 RISC DICER

Non solo mRNA….Chromatin remodelling!

Geni non codificanti nell’uomo? mRNA tRNA ncRNA snRNA: spliceosome snoRNA: rRNA-tRNA-snRNA modifications rRNA GENE PROTEINA Cis-AS-RNA: XIST miRNA asRNA

miRNA nell’uomo NB: computationl tools developed on the basis of known miRNA seq identified 255 putative human miRNA encoding genes! miR181 is a hematopoietic specific miRNA that drive differentiation of stem cell to the Blineage 52% of analized miRNA map to genomic site involved in cancer

mRNA Antisenso nell’uomo

RNAi un nuovo strumento per lo studio della funzione genica nei mammiferi Major limitation long dsRNA >30nt is effective in mammals, but induce many protective pathway Long dsRNA trigger PKR IFN RNAseL apoptosis dsRNA degradation Block of protein synthesis Phosp of ElF2a

Elbashir, S. M. et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature (2001). 2nt increase stability easier synthesis Source for siRNA: Dharmacon MWG Ambion

siRNA transfection Vettori a DNA per RNAi ? CONTRO PRO TRANSIENT: siRNA are stable, Rate of cell growth Dilution Protein half-life EFFICIENCY OF TRANSFECTION: Some cells are refractory to transfection Electroporation leads to cell death COST: siRNA are chemically sinthetized, therefore very expensive AND NOT RENEWABLE…. Use in vivo????? siRNA is transfection is very efficient in most cell lines siRNA silencing is immediate Vettori a DNA per RNAi ?

promoteri RNA polIII: U6 e H1 sintesi di short hairpin RNA (shRNA) e siRNA in vivo Nessuna sequenza richiesta dopo start site per la trascrizione TTTT: sufficiente per terminazione PRO Cheap Stable clones for long term experiments Long half life protein targeted CONTRO Interference require trasncription: timing…. Transfection is less efficient More efficiently processed by DICER!! DNA mediated RNAi. H1/U6 clonati in vettori plasmidici VIRUS vector mediated RNAi: H1/U6 clonati in vettori retrovirali: lintegrazione stabile nel genoma oncoretrovirus MoMuLV or MSCV silenziamento del provirus durante lo sviluppo le cellule devono essere nel ciclo cellulare per poter essere infettate lentivirus HIV-1 nessun silenziamento: Topi transgenici infettano cellule quiescenti (cellule staminali….)

Plasmid vector

retroviral vector Growth signal RAS proliferazione RAS (GTP binding protein): tra gli oncogeni più frequentemente mutati nei tumori umani (30-50%) (RAS-v12: Attivazione costituiva nello stato legato a GTP) Proliferazione, differenziamento, migrazione e sopravvivenza cellulare. wtRAS è essenziale per la sopravvivenza della cellula

retroviral vector H1 promotercloned in ppMSCV puro retroviral vector:pRETROsuper Stably integrates in cell genome

siRNA nel trattamento dei tumori umani: Terapia anticancro: Nessuna tecnologia è in grado di colpire esclusivamente l’espressione di un oncogeno mutante attivato

Limitazioni dell’RNAi stabile: impossibile studiare geni essenziali per sopravvivenza cellulare (housekeeping) e sviluppo Sviluppo di nuovi vettori per l’espressione condizionale-inducibile dei shRNA tetOFF/ON H1 and U6 promoter system tossicità background

Disegnare l’siRNA perfetto 1) stability of the hairpin 2) access to RISC 9nt loop 2nt TT overhang Low GC content Empirical observation Structure of miRNA

Regole per la produzione di siRNA Mittal, Nature Review Gentic, 2004 29 su 30 dsRNA inducono più 50% silencing su 6 geni target

Specificità…? NO SI siRNA against endogenous gene can affect other genes with weak sequence similarity siRNA against endogenous GFP expression didn’t affecct any other gene Use indipendent siRNA against same target Rescue the observed Loss of Funtion phenotype by expressing the target gene with a silent mutation in the target region

functional screenings High-throughput functional screenings

Attivazione di ONCOGENi Inattivazione di TUMOR SUPPRESSOR Genomewide screenings for critical players in human cancer normal cell cancer cell controlled growth uncontrolled growth Genetic lesions Attivazione di ONCOGENi Inattivazione di TUMOR SUPPRESSOR

Tumori diversi hanno caratteristiche comuni Tumor suppressors p53 pRb Hannan and Weinberg, 2000

Possibile ruolo dei miRNA nei tumori umani Target mRNA Overspressione di un oncogene Silenziamento di un TS

Identificazione di nuovi oncogeni o TS Normal cell + siRNA library Tumor phenotype RNAi silenzia un Tumor suppressor Cancer cell + siRNA reversion of tumor phenotype RNAi silenzia un oncogene

? Sequenziamento del genoma umano Annotazione di tutte le possibili ORF Costruzione di siRNA contro tutti i geni umani ? Genome wide functional screenings

Loss of funtion screenings by RNAi

Infect cells with siRNA library Phenotype of interest The targeted gene is required for the phenotype How can we identify the targeted gene? PCR with primer flanking the siRNA encoding DNA sequnece cloning sequencing

ASSAY Colony formation: primary cells plated at low density undergo growth arrest and senescence CELL SYSTEM Primary Human fibroblast (BJ) infected with temperature sensitive LargeT from SV40: Human fibroblast (BJ)+ts largeT

To increase knockdown: shRNA library: 7914 genes Cell-cycle Transcription Signal transduction Methabolism Genes involved in cancer To increase knockdown: 3 shRNA/gene 70%inhibition for 70% of the genes single clone isolation PCR with primer flanking the siRNA oncoding DNA sequence cloning sequencing RPS6KA6, HTATIP, HDAC4, CCT2, KIAA0828

THE EFFECT IS GENE SPECIFIC

THE targeted GENES ARE IN THE p53 PATHWAY U2OS: osteosarcoma cells THE targeted GENES ARE IN THE p53 PATHWAY IONIZING RADIATION

Identified genes affect the expression of a p53 target gene bax p21

Limitations: single clone isolation re-cloning and retesting Infect cells select phenotype Single cell derived clones Re-Cloning and sequencing Test again siRNA BAR-CODE screens Stably integraetd vectors introduce a molecular fingerprint in the infected cell: The 19 hairpin sequence is gene specific and behave as a MOLECULAR BARCODE Relative abundance of BARCODE in a cell population reflect the effect of the knockdown on cell viability Infect cells select population with phenotype PCR of hairpin sequence Fluorescent labeling Hybridize to DNA Microarray containing hairpin sequences from library Identification of highly represented shRNA

Silenziamento genico specifico, efficiente e stabile nel tempo (economico e veloce). Genetica inversa alla portata di tutti. Genome-wide functional screenings. Terapia genetica antitumorale. Rivoluzione nella comprensione dei meccanismi di regolazione dell’espressione genica.