Felix qui potuit rerum cognoscere causas Lucrezio (De rerum natura)

Come si ottiene un aumento di flusso? Aumentando S Sottraendo P Aumentando enzima Aumentando attività Causano aumenti locali che faticano a propagarsi lungo la via (dampening) Esaminiamo alcuni esempi di aumenti di flusso in vivo * In lievito nello switch tra fermentazione a respirazione (DeRisi, 1997) * Nel seme durante la mobilizzazione delle riserve lipidiche (Rylott, 2001) * Sintesi dei lipidi durante l’embriogenesi di Arabidopsis (O’Hara, 2002) * Altri esempi (vedi Fell)

Diauxic shift in yeast Rosso = Aumento Verde = Diminuzione Exploring the Metabolic and Genetic Control of Gene Expression on a Genomic Scale (DeRisi et al., 1997) Quali sono i geni che vengono attivati e quali vengono disattivati nella transizione da fermentazione a respirazione?  Microarray con tutti i geni di lievito ibridato con mRNA a vari tempi di crescita Rosso = Aumento Verde = Diminuzione

Seguiamo i trascritti nel tempo

Passando da fermentazione a respirazione cosa cambia nel metabolismo? PYK1 4.9  Variazione  Gene interessato Rosso = Aumento Verde = Diminuzione

Molti geni sono regolati in modo simile

Variazione coordinata di molti geni E’ possibile classificare i geni in base alla regolazione:  6 classi

Lipid mobilization in Arabidopsis germinating seeds Schematic representation of the pathways involved in storage lipid mobilization in oilseeds: 1, ACX; 2, multifuctional protein; 3, thiolase; 4, MS; 5, ICL; 6, PEPck.

Northern analysis Rylott EL, Hooks MA, Graham IA. (2001) Co-ordinate regulation of genes involved in storage lipid mobilization in Arabidopsis thaliana. Biochem Soc Trans. 29:283-7. (A) Stages of seedling development (B) Northern blot analysis of gene expression from 0 to 8 days after imbibition

Enzimi coinvolti ACC Malonyl-CoA transacilasi KAS III, II & I FAS - Acido grasso sintasi

Lipid synthesis during embryogenesis 3-oxoacyl-ACP reductase (KR) biotin carboxylase (BC) acyl-ACP thioesterase (TE) enoyl-ACP reductase (ENR) acyl-carrier protein (ACP) O'Hara, P., et al. Plant Physiol. 2002;129:310-320 FAS Components Exhibit Constant mRNA Ratios

Abbondanza relativa dei trascritti It was demonstrated recently that mRNAs encoding the four subunits of heteromeric (ACCase) acetyl-CoA carboxylase accumulate at a constant molar ratio throughout silique development in Arabidopsis. The ratios were found to be CAC1:CAC2:CAC3:(accD-A & accD-B) = 0.14:1.0:0.17:0.06 (Ke et al., 2000)

Via del triptofano in lievito Provate a suggerire motivi per la discrepanza tra Δei e ΔJ Solo la simultanea espressione di molti (tutti) i geni causa un ΔJ paragonabile al ΔEi (ΔJ ≃ CJ x ΔEi )

Lütke-Eversloh T, Stephanopoulos G Lütke-Eversloh T, Stephanopoulos G. (2008) Combinatorial pathway analysis for improved L-tyrosine production in Escherichia coli: identification of enzymatic bottlenecks by systematic gene overexpression. Metab Eng. 10:69-77.

Come fa la natura? Strategia multisito! Molti altri esempi: Lipogenesi nei tessuti animali Fotosintesi Ciclo dell’urea Gluconeogenesi Sintesi degli steroidi Operoni batterici, enzimi di fusione… ……u.s.w. Come fa la natura? Strategia multisito!

Il “metodo universale” P B J1 = J2 + J3 Per aumentare J3 di 5 volte, dovremo amplificare tutti gli enzimi che da S portano a P di 5 volte. Questo comporta un consumo di addizionale di S. Se vogliamo mantenere intatta [S], occorre aumentare J1 fino al valore di (J2 +5J3) J1 J2 J3 N sta per Nutrienti, S per Substrato, P per Prodotto e B per Biomassa. Ogni trasformazione (es. S-> P) comporta diversi passaggi enzimatici. J1'= (J2 + J3') = (J2 + 5J3) Se J2 >> J3 allora si può trascurare di aumentare J1. In caso contrario si rischia di danneggiare J2

N P S1 B1 S3 S2 B2 B3 J1 = J2 + J3 + J4 + J5 J1 J2 Il metabolismo è chiaramente più complesso, con tanti flussi diversi, presenza di cicli con cofattori (major obstacle) J3 J4 J’1 = (J2 + J3 + J4 + 5J5) J5 Si può risalire da P verso N lungo le vie metaboliche fino a dove l’aumento di flusso può essere trascurato.

Se il metodo universale viene implementato in vivo, ci aspettiamo che: Quando la quantità degli enzimi cambia in risposta a stimoli fisiologici o ambientali, la proporzione relativa rimane costante. Il fattore di aumento dell’attività enzimatica corrisponda al fattore di aumento del flusso. Il livello di cambiamento sia maggiore nel ramo metabolico interessato mentre i tratti a monte della ramificazione vadano incontro a cambiamenti di entità minore. Oltre all’induzione degli enzimi interessati (maggior quantità) altri meccanismi di controllo possono essere adoperati in diversi siti.     Phenotype is flux! Ma qualche volta phenotype is concentration

Evidenze sperimentali Reguloni! La concentrazione dei metaboliti varia molto meno del flusso * Rate limiting step concept: more misguided than even MCA initially suggested * Agire su un solo punto è poco efficace e potrebbe essere deleterio Il metodo universale mantiene costanti le concentrazioni dei metaboliti [Si]  evita effetti negativi dovuti all’aumento o alla riduzione di [Si]

Referenze Referenze ai lavori sugli aumenti naturali in vivo Vedi anche Fell ultimo cap * DeRisi JL, Iyer VR, Brown PO. DeRisi JL, Iyer VR, Brown PO. (1997) Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale. Science. 278:680-6. * O'Hara P, Slabas AR, Fawcett T. (2002) Fatty acid and lipid biosynthetic genes are expressed at constant molar ratios but different absolute levels during embryogenesis. Plant Physiol. 129:310-20 * Rylott EL, Hooks MA, Graham IA. (2001) Co-ordinate regulation of genes involved in storage lipid mobilization in Arabidopsis thaliana. Biochem Soc Trans. 29:283-7. * Niederberger P, Prasad R, Miozzari G, Kacser H. (1992) A strategy for increasing an in vivo flux by genetic manipulations. The tryptophan system of yeast. Biochem J. 287:473-9. * Zhao J, Last RL.(1996) Coordinate regulation of the tryptophan biosynthetic pathway and indolic phytoalexin accumulation in Arabidopsis. Plant Cell. 8:2235-44. * Eastmond PJ, Rawsthorne S. (2000) Ccoordinate changes in carbon partitioning and plastidial metabolism during the development of oilseed rape embryos. Plant Physiol. 122:767-74 * Universal method: Kacser and Acerenza (1993) A universal method for achieving increases in metabolite production Eur J. of Biochemistry 216:361-367