HEMATOLOCICAL CLONAL DISORDERS (MALIGNANCIES) LYMPHO- PROLIFERATIVE DISORDERS MYELOID DISORDERS MYELO- APLASTIC (?) MYELO- DISPLASTIC MYELO- PROLIFERATIVE

MOLECULAR PATHS TO CANCER I PROLIFERATION APOPTOSIS DIFFERENTIATION

Neoplasie della linea mieloide - Malattie mieloproliferative croniche - Sindromi mielodisplastiche Leucemia acuta mieloide Origine quasi sempre da cellula staminale pluripotente

NEOPLASIE MIELOIDI Mielopr. Cron. Differenziazione normale Sindr. Mielodispl. differenziazione Leuc. Ac. mieloide differenziazione

MYELO-PROLIFERATIVE DISORDERS ACUTE expansion of poorly differentiated elements often with bone marrow functional failure example: acute myeloid leukemia de novo short survival if untreated CHRONIC expansion of well differentiated elements from bone marrow failure to bone marrow hyperfunction example; cronic myeloid leukemia, policitemia vera, essential thrombocytopenia prolonged survival if left untreated tend to loose differentiation with time

MYELOPROLYFERATIVE DISORDERS OFTEN INDUCED BY THE PRESENCE OF FUSION TRANSCRIPTS

FUSION TRANSCRIPTS: ARE A KIND OF DYSREGULATION THAT OCCURR PREFERENTIALY IN MYELOPROLIPHERATIVE DISORDERS IN MATURE LYMPHOID TUMORS, TRANSLOCATIONS OFTEN LEAD TO OVEREXPRESSION OF NORMAL GENES (except npm-alk)

CHRONIC MYELOPROLIFERATIVE DISORDERS CLONAL PROLIFERATION OF CELLS WITH GOOD DIFFERENTIATIVE POTENTIAL

MOLECULAR PATHS TO CANCER PROLIFERATION APOPTOSIS DIFFERENTIATION

(loss of physiological control) CML IN CHRONIC PHASE PROLIFERATION (loss of physiological control) APOPTOSIS DIFFERENTIATION

Malattie mieloproliferative croniche Alterazione genetica Cellule staminali espansione Emopoiesi monoclonale, espansione dei progenitori, iperproduzione cellule mature, instabilità genetica Ulteriore alterazione genetica Leucemia acuta mieloide

Malattie mieloproliferative croniche Leucemia mieloide cronica: iperproduzione di granulociti +/- piastrine Mielofibrosi con metaplasia mieloide: iperproduzione di granulociti +/- piastrine (fase iniziale) Policitemia vera: iperproduzione di eritrociti, piastrine, granulociti Trombocitemia essenziale: iperproduzione di piastrine Tipiche dell’ età adulta: età mediana 55 – 65 anni

Myeloproliferative disorders CHRONIC MYELOGENOUS LEUKEMIA (CML) IDYIOPATIC MYELOFIBROSIS (IMMM) POLICITEMIA VERA (PV) ESSENTIAL THROBOCYTEMIA (TE) DISEASE SEVERITY GENETIC INSTABILITY

NATURAL HISTORY OF CMD CHRONIC MYELOGENOUS LEUKEMIA (CML) IDYIOPATIC MYELOFIBROSIS (FLORID PHASE) POLICITEMIA VERA ESSENTIAL THROBOCYTEMIA ACCELERATED PHASE SPENT (HYPERFIBROTIC) MPD MAJOR THROMBOTIC EVENT BLASTIC (ACUTE) PHASE

MPD CLINICAL FEATURES I Characteristic CML IMMM PV TE High WBC ++++ ++ ++ ± ± to - -- to + High Hematocrit ++++ ± High PLTS +++ -- to ++ +++ ++++ Large spleen +++ ++++ ++ ± ± to + Throbotic risk +++ ++++ +++ ++++ -- Hypercellular BM +++ ++ Myeloid metaplasia +++ ++++ ++ ± Progression to AL ++++ ++ + ±

MPD CLINICAL FEATURES I Characteristic CML IMMM PV TE Prognosis (years) 5-6* 10 15 20-25 Knowledge of genetic basis ++++ ± ± ± ++++ ± ± ± Specific therapy *Pre-Glivec data

Trombocitemia essenziale Alterazioni cromosomiche molto rare. Espansione prevalente dei progenitori megacariocitari. Nel sangue piatrinosi > 600.000/ul, a volte molto elevata, > 1.500.000/ ul; raramente lieve leucocitosi con neutrofilia, quasi mai cellule immature circolanti. Midollo osseo normo-ipercellulare, con netto aumento dei megacariociti, spesso iperploidi Dopo circa 10 anni possibile evoluzione in mielofibrosi secondaria, raramente (1-5 % dei casi ) in LAM

Trombocitemia essenziale Sintomi: spesso paziente asintomatico (riscontro casuale); a volte sintomi di alterazioni del microcircolo: vertigini, acufeni, cefalea, parestesie alle estremità. Frequenti le complicanze vascolari trombotiche: infarto miocardio, ictus trombotico. Raramente diatesi emorragica. Diagnosi: escludere le piastrinosi secondarie (valutare sideremia, VES, cercare eventuali sintomi di neoplasie); escludere altre malattie mieloproliferative croniche: biopsia ossea, indagine molecolare per ricerca BCR/ABL.

Trombocitemia essenziale PROGNOSI E TERAPIA Sopravvivenza mediana circa 20 anni Causa di morte più frequente: incidenti vascolari Terapia anti-aggregante piastrinica se non vi è diatesi emorragica; citostatici (idrossiurea) se piastrine > 1.000.000 /ul o > 700.000 /ul e età > 60 anni o altri rischi vascolari; interferone alfa: idem se < 60 anni

Policitemia vera Alterazioni citogenetiche molto rare (20 q-) Ipersensibilità dei progenitori del clone mutato ad eritropoietina ed altre citochine (IL3, SCF). Aumento della massa eritrocitaria per iperproduzione: aumento progressivo Hb fino a valore > 20 g/dl ed Ht fino a > 60%; spesso anche piastrinosi moderata (400-800.000 /ul e lieve leucocitosi (10-20.000/ul) con neutrofilia. Non cellule immature circolanti. Raramente lieve splenomegalia. Cellularità midollare aumentata, fibrosi scarsa o assente. Nelle fasi avanzate (oltre 5-10 anni) tendenza a fibrosi midollare e riduzione della cellularità (evoluzione in mielofibrosi secondaria). 2 - 10% evoluzione in LAM.

Policitemia vera Sintomi e segni: conseguenti all’ iperviscosità ematica: vertigini, cefalea, dispnea da sforzo; rossore cutaneo, ipertensione; prurito dopo il bagno; alto rischio di incidenti vascolari: infarto miocardico, ictus trombotico, trombosi venosa profonda. In fasi avanzate possibili sintomi di citopenia (anemia)

Policitemia vera DIAGNOSI Escludere una eritrocitosi secondaria Criteri maggiori: massa eritrocitaria aumentata, O ht >64 normale saturazione di O2 dell’ Hb, splenomegalia Citogenetica alterata Esclusione di ogni altra causa Criteri minori: piastrinosi, leucocitosi, aumento fosfatasi alcalina leucocitaria, aumento vitamina B12 sierica. Richiesti 3 criteri maggiori o 2 maggiori + 2 minori. Attualmente importanti: dosaggio eritropoietina sierica (ridotta o ai limiti inferiori di norma), coltura in vitro progenitori eritroidi (crescita BFU-E senza aggiunta di eritropoietina)

Policitemia vera PROGNOSI E TERAPIA Sopravvivenza mediana 19 anni (più breve nei pazienti > 60 anni). Causa di morte più frequente: complicanze vascolari LAM più frequente nei pazienti che richiedono terapia citostatica. Trattamento principale è il salasso: ottenere Ht < 45% ; anti-aggreganti piastrinici se piastrinosi e/o precedenti trombosi. Chemioterapia citostatica (idrossiurea, pipobromano) indicata se piastrinosi + età >60 o altri rischi trombotici o insufficiente controllo dell’ eritrocitosi con salassi. Trattamento sperimentale: interferone alfa

Mielofibrosi con metaplasia mieloide Possibile anomalie citogenetiche non specifiche (+8, 20q-, 13q-). Espansione progenitori mieloidi e megacariocitari Emopoiesi extra- midollare (milza e fegato) Megacariocitopoiesi in parte inefficace Lisi intramidollare di megacariociti Liberazione fattori di crescita per fibroblasti ed endotelio (PDGF, VEGF) Progressiva fibrosi midollare e aumento emopoiesi extra-midollare: con il tempo citopenia ed epato/splenomegalia ingravescente

Mielofibrosi con metaplasia mieloide Fase iniziale: frequente leucocitosi, raramente piastrinosi; Hb normale o lievemente ridotta; splenomegalia lieve/moderata. Paziente asintomatico o lievi sintomi di splenomegalia; raramente sintomi infiammatori (febbre, artralgie, sudorazioni) Fase avanzata : anemia, piastrinopenia +/- leucopenia; splenomegalia imponente, sintomatica (dolori addominali, difficoltà all’ alimentazione). Sintomi di anemia e di splenomegalia, deperimento, complicanze infettive ed emorragiche. Evoluzione in LAM in circa il 20% dei casi

Mielofibrosi con metaplasia mieloide DIAGNOSI Sospetto per leucocitosi e/o splenomegalia. Esame dello striscio di sangue periferico: presenza di precursori granulocitari (mieloblasti- metamielociti, blasti < 5% ) ed eritroidi (eritroblasti); presenza di eritrociti a lacrima (dacriociti) Aspirato midollare: quasi sempre “punctio sicca” Biopsia ossea: cellularità e fibrosi di grado variabile secondo lo stadio, iperplasia megacariocitaria con displasia. Biologia molecolare: escludere presenza di BCR/ABL

Mielofibrosi con metaplasia mieloide PROGNOSI Sopravvivenza mediana 4 - 5 anni, ma molto variabile: 2-3 anni se anemia (Hb < 10 g/dl) o sintomi infiammatori o GB > 30.000 /ul o blasti circolanti >3% > 10 anni se nessuno dei fattori prognostici negativi TERAPIA Fase iniziale: idrossiurea se leucocitosi, piastrinosi o splenomegalia. Fase avanzata: trasfusioni, androgeni, eventuale splenectomia o radioterapia splenica. Terapie sperimentali: trapianto di midollo, eritropoietina ricombinante

CML: A MODEL FOR CANCER PATHOGENESIS The first neoplasms treatable with a smart drug

LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA (LMC) PATOGENESI Nel 90 % dei casi presente traslocazione cromosomica t (9;22): cromosoma Filadelfia (Ph1), con scambio tra i geni BCR e ABL. Sul cromosoma 22 formazione di gene ibrido BCR/ABL, che codifica per proteina di fusione BCR/ABL con spiccata attività tirosino-chinasica.

LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA PATOGENESI In 5% dei casi fusione genica BCR/ABL senza riscontro citogenetico del cromosoma Ph1 (casi Ph1- ma BCR/ABL+): stessa malattia, prognosi e risposta terapeutica. Solo 5% dei casi è BCR/ABL negativo: LMC atipiche, molto rare e a prognosi peggiore.

LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA PATOGENESI La tirosino-chinasi BCR/ABL fosforila diversi substrati, riproducendo gli effetti di una stimolazione continua con fattori di crescita . vantaggio proliferativo della cellula staminale mutata e della sua progenie e instabilità genetica che predispone a ulteriori mutazioni. L’ acquisizione di ulteriori mutazioni porta all’ evoluzione a leucemia acuta.

PATOGENESI LMC 9 q 22 q bcr abl 9 q 22 q bcr/abl Tirosino-chinasi abl/bcr ininfluente\ Tirosino-chinasi

PATOGENESI LMC Chinasi BCR/ABL fosforilazione Attivazione ras stimolo proliferativo Effetto anti- apoptotico Ridotta adesività a stroma Instabilità genetica Perdita sensibilità a inibitori proliferazione

RELATIONSHIP BETWEEN CML CELS AND ENVIROMENT GRRR….

CP-CML CELLS REQUIRE LESS SURVIVAL/PROLFERATIVE SIGNALS BY STROMAL CELLS DO NOT REQUIRE ADHESIVE MOLECULES IMPAIR DIFFERENTIATION AND SURVIVAL OF THEIR NORMAL COUNTERPARTS LESS SENSITIVE TO INHIBITORY/APOPTOTIC STIMULI

CP-CML CELLS

NLS: Nuclear Localisation Signal The abl-gene homologous to v-abl IN G1 it is bound by Rb1 Knock-out mice are leukopenic when overexpressed --> cell cycle arrest ABL protein ATP bind NH2 SH3 SH2 SH1 NLS DNA BINDING ACTIN BINDING COOH Protein interaction Tyr Kinase NLS: Nuclear Localisation Signal

The BCR-gene Ubiquitous expression cytoplasmic, but pericromosomic during mitosis Knock-out have nearly normal hematopoiesis BCR protein DD Ser/Trh kinase DBL/GAP PH NH2 COOH 177Y Dimerization domain Sh2 binding

Characteristics of bcr-abl Only cytoplasmic permanently activated several targets it mimics some TK receptors, inducing constitutive activation of several pathways bypass of regulatory mechanisms

Proliferative stimulus Apoptosis inhibition Proliferative stimulus

Malattie mieloproliferative croniche Alterazione genetica Cellule staminali espansione Emopoiesi monoclonale, espansione dei progenitori, iperproduzione cellule mature, instabilità genetica Ulteriore alterazione genetica Leucemia acuta mieloide

A TRIPHASIC DISEASE ACCELERATED PHASE BLASTIC PHASE CHRONIC PHASE

LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA: STORIA NATURALE Fase cronica: 4 anni (1 - >10). -Leucocitosi: 20 - 100.000 / l nei casi a diagnosi occasionale, 100 - > 400.000 nei casi sintomatici, con neutrofilia; -frequente basofilia e costante presenza di precursori granulocitari (promielociti – metamielociti, blasti 1 –5% nei casi con iperleucocitosi). Frequente piastrinosi moderata (400.000 – 1.000.000/ l), raramente iperpiastrinosi (> 1.000.000/ l) e leucocitosi minima.

LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA: STORIA NATURALE Fase cronica - Eritrociti nella norma o lieve anemia. Splenomegalia frequente, che correla con l’ entità della leucocitosi. Midollo osseo ipercellulare, con spiccata iperplasia granulocitopoietica, normale maturazione (blasti < 5%), aumento dei megacariociti; fibrosi assente o scarsa. - Sintomi assenti o aspecifici: astenia, dimagrimento, sudorazioni, tensione o dolori addominali da splenomegalia, nei casi con iperleucocitosi.

LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA: STORIA NATURALE Fase accelerata Durata 6 – 12 mesi; può anche mancare nei casi a trasformazione acuta. Possibile comparsa di ulteriori alterazioni del cariotipo. Iniziali segni di alterata maturazione emopoietica: aumento cellule immature nel sangue e nel midollo, spesso anemia, piastrinopenia o piastrinosi, incremento della basofilia. Frequente incremento della splenomegalia, indipendente dalla leucocitosi. -Frequente accentuazioni di sintomi infiammatori: astenia, sudorazioni, febbre, dolori ossei.

LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA: STORIA NATURALE Fase blastica -Sopravvivenza di pochi mesi. -Frequenti anomalie aggiuntive del cariotipo (due cromosomi Ph1, +8, inversione del 17). -Quadro ematologico di leucemia acuta (mieloide nel 70%, linfoide nel 30% dei casi): leucocitosi con blasti midollari o periferici > 20%, anemia, piastrinopenia, granulocitopenia. Frequente epato-splenomegalia, a volte adenopatie. - Frequenti sintomi di anemia, dolori addominali per splenomegalia, febbre, dimagrimento, infezioni e diatesi emorragica. Morte di solito per infezioni o emorragia.

(loss of physiological control) CML IN BLASTIC PHASE PROLIFERATION (loss of physiological control) APOPTOSIS DIFFERENTIATION

CML EVOLUTION TELOMERE SHORTENING AND TELOMERASE ACTIVATION P53 INCTIVATION EPIGENETIC SILENCING ADDITIONAL TRANSLOCATIONS

LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA: DIAGNOSI Sospettata per leucocitosi con neutrofilia (soprattutto se GB > 20.000 / l) e presenza di cellule immature circolanti  piastrinosi. Conferma mediante esame citogenetico su sangue midollare e/o ricerca dell’ RNA del gene ibrido BCR/ABL su cellule midollari o sangue periferico. Se la citogenetica non evidenzia il cromosoma Ph1 ma il quadro ematologico è sospetto per LMC, eseguire ricerca BCR/ABL.

LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA: PROGNOSI Con chemioterapia tradizionale la sopravvivenza mediana ERA DI 4 anni; con ampie variazioni individuali (< 2 - > 10), secondo fattori prognostici. La valutazione più usata (“score” di Sokal) considera fattori negativi: splenomegalia, piastrinosi, % di blasti circolanti, età. 3 gruppi: basso rischio (50%, sopravviv. mediana 5 – 6 anni), rischio intermedio (25-30%, sopravviv. mediana 3 – 4 anni), alto rischio (20 – 25%, sopravviv. mediana 2 anni). Basso rischio ha anche più probabilità di risposta citogenetica alle moderne terapie.

LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA: PROGNOSI - Con moderne terapie (trapianto di midollo allogenico, interferone , inibitore della tirosino-chinasi BCR/ABL) fondamentale la risposta citogenetica maggiore: riduzione > del 65% o scomparsa delle cellule con cromosoma Ph1 dal midollo osseo. - Se scomparsa del cromosoma Ph1, sopravvivenza a 10 anni del 70 – 90%. - Importante monitorare la risposta alle terapie con esami citogenetici periodici (ogni 6-12 mesi).

LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA: TERAPIA Chemioterapia tradizionale (idrossiurea, busulfano) - effetto solo palliativo, può normalizzare i valori di GB e piastrine, ma non induce regressione del clone neoplastico: sopravvivenza mediana circa 4 anni; Indicazioni attuali: trattamento iniziale per rapida riduzione leucocitosi; terapia per pazienti molto anziani; palliativo per pazienti non responsivi ad altre terapie.

LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA: TERAPIA Interferone   citosina arabinoside - Risposte citogenetiche maggiori: 20 – 50 %, risposte complete 10 – 30 % ; risposte complete durature solo nei casi a basso rischio. Possibili guarigioni ? Non tollerato dal 20% dei pazienti, soprattutto dagli anziani: astenia, mialgie, depressione, febbre, complicanze autoimmuni. Inefficace in fase accelerata o blastica.

LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA: TERAPIA Trapianto di midollo allogenico - Può guarire circa il 60% dei pazienti in fase cronica (scomparsa permanente del cromosoma Ph1 e dell’ RNA di BCR/ABL) se < 45 anni e con donatore famigliare HLA compatibile. - Mortalità da trapianto circa 20%. - Recidive circa 20% (in parte recuperabili con infusione di linfociti del donatore).

LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA: TERAPIA Trapianto di midollo allogenico Aumento mortalità se età > 45 anni o donatore non famigliare o malattia in fase accelerata o cronica da più di 1-2 anni. Mortalità < 10% se età < 30 anni, donatore consanguineo HLA identico e durata malattia < 1 anno. Guarigioni più rare (30%) in fase accelerata; quasi sempre inefficace in fase blastica.

OGGI E’ USATO CON ASSAI POCO ENTUSIASMO

LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA: TERAPIA STI 571 (imatinib) Inibisce l’ attività tirosino-chinasi della proteina di fusione BCR/ABL, bloccando sito di legame con ATP. - Arresto proliferativo e induzione di apoptosi nelle cellule di LMC.

MECCANISMO DI AZIONE DI STI-571 Bcr/abl substrato fosforilato Bcr/abl ATP P substrato non fosforilato Bcr/abl Bcr/abl STI571 ATP

LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA: TERAPIA STI 571 (imatinib) Altamente efficace in fase cronica: 50-70% risposte citogenetiche complete. Non noti effetti a lungo termine, perché esperienza ancora recente (PIU’ PASSA IL TEMPO PIU’SONO BUONI). Efficacia moderata in fase accelerata (30 – 40% risposte citogenetiche maggiori). Beneficio solo temporaneo (2-3 mesi) in fase blastica

TERAPIA LMC IN FASE BLASTICA Terapia come per leucemie acute, ma scarsi risultati: se blasti di tipo linfoide (30% dei casi), 70% di risposte complete a chemioterapia (2a fase cronica) ma durata di pochi mesi; se trasformazione in leucemia acuta mieloide 30% risposte complete e di breve durata con chemioterapia intensiva o con STI571; qualche possibilità di lunga sopravvivenza solo se trapianto allogenico in 2a fase cronica.

CONCLUSIONS UNDERSTANDING THE MOLECULAR PATHOGENESIS OF CML ALLOWED THE DEVELOPMENT OF EFFECTIVE NON TOXIC DRUGS (STI 571) ADDITIONAL DRUGS ARE UNDER EALUATION A GOOD MODEL FOR ONCOGENE-TARGETING THERAPIES