NETWORK CITOCHINICO E ALLERGIE RESPIRATORIE Sebastiano Gangemi U.O.C. e Scuola di Specializzazione di Allergologia e Immunologia Clinica Università degli Studi di Messina A.O.U.”Gaetano Martino”

ATOPIA E INFIAMMAZIONE ALLERGICA PATTERN GENETICO Ambiente Fattori Materni Infezioni Linfocita Th2 Linfocita Th1 ATOPIA Treg

COINVOLGIMENTO DEL SISTEMA IMMUNE NELLA FLOGOSI ALLERGICA Concentrazione sierica di anticorpi (IgE, IgG4, IgG1, IgA) Cellule effettrici e regolatorie: - Eosinofili - Mastociti - Basofili - Linfociti T e B - C. Dendritiche

Immunoterapia specifica ed IgE Ovviamente l’incremento delle IgE è una caratteristica delle allergie respiratorie anche se spesso non vi e’ corrispondenza tra i livelli di IgE specifiche e totali e la gravita’ dei sintomi Immunoterapia specifica ed IgE Inizio ITS: incremento IgE specifiche (effetto “booster”) Dopo 6 mesi: rinormalizzazione valori IgE specifiche Dopo periodo > 1 anno: calo (non sempre presente) delle IgE specifiche Questo meccanismo ha perso di considerazione negli ultimi anni perché la riduzione delle IgE è tardiva, contenuta e non sempre presente

IgG L’incremento dei livelli sierici di IgG4 (“Ab bloccanti”) è correlato con il miglioramento clinico delle malattie allergiche Wachholz PA, et al. Curr Opin Allergy Clin Immunol. 2004 L’incremento dei livelli sierici di IgG4 (“Ab bloccanti”) : - è soprattutto IL-10-dipendente - blocca il rilascio di istamina allergene-dipendente ed IgE-indotto dai basofili - IgG4 per il veleno di imenotteri correla con la protezione da successive punture Nouri-Aria KT et al. J Immunol. 2004 Muller UR et al. Allergy 1989

IgA Nei soggetti sani la risposta immune a Der p1 provoca l’incremento dei livelli di IgA specifiche (insieme alle IgG4 e meno alle IgG1) Ciò non avviene nei soggetti allergici e’ il TGF-beta ad indurre la produzione di IgA (prodotto soprattutto dalle cosiddette cellule Th3) Jutel M et al. Eur J Immunol 2003

mastcellule, eosinofili Negli allergici avviene una migrazione transepiteliale delle mastcellule durante la rinite, la cui riduzione è proporzionale al miglioramento dei parametri clinici In modelli murini, l’iniezione sottocutanea di peptidi allergenici down-regola le risposte delle mast-cellule Bentley AM et al. JACI 1992 Treter S et al. Cell Immunol 2003 - dopo test di scatenamento nasale si ha incremento del numero di eosinofili nel liquido di lavaggio nasale - durante il picco pollinico nei pollinosici avviene un incremento della reattività bronchiale all’istamina e del numero di eosinofili ed ECP nel BAL durante la stagione pollinica negli asmatici allergici avviene il priming della adesione eosinofila alla betulla Furin MJ et al. JACI 1991; Rak S et al. JACI 1988; Hakansson et al. JACI 1997

T helper cell commitment towards specific lineages STAT-4 T-bet TNF-a IFN-g Th1 STAT-6 GATA-3 IL-4 IL-5 IL-13 induction IL-12 TGF-g Th2 induction IL-4 Foxp3 induction cell-cell contact Th naive TGF-b Treg CD4+CD25+ induction Uncommitted (naive) CD4+ T helper cells IL-6 TGF-b IL-10 TGF-b Proliferationcytokine production Treg Tr1 Th3 IL-23 RORgt IL-17 IL-22 IL-21 Th17 Korn T et al. Nature 2007 Nurieva R et al. Nature 2007 Afzali B et al. Clin Exp Immunol 2007 IL-21 Th17 Autocrine regulation

SUBSETS CELLULE T EFFETTRICI IL-2, IFN-gamma, TNF-beta Th1 Th2 IL-2, IFN-gamma, TNF-beta IL-4, IL-5, IL-9, IL-13 Recentemente è stato identificato un altro subset di T helper cells denominato Th17 (produce IL-17 e IL-22) fortemente implicato nei fenomeni autoimmuni (p.e. encefalomielite sperimentale autoimmune, artrite collageno-indotta, psoriasi) oltre che nella immunità innata contro le infezioni (specie verso batteri extracellulari) Zheng Y et al. Nature Feb 2007 Furuzawa-Carballeda J et al. Autoimmun Rev Jan 2007

Polarizzazione e funzioni delle TH17 IL-6 IL-21 Polarizzazione e funzioni delle TH17 TGF-b T naive Kaiko GE et al, Immunology 2007 IL-23 Nucleo TGF-b IL-23R differenziazione IL-17,IL-17F,IL-6, IL-22,IL-21,TNF-a STAT3 RORgt Th17 Fibroblasti, macrofagi, c.endoteliali/epiteliali Nucleo mediatori infiammatori rilascio di chemochine Batteri Extracellulari malattie Autoimmuni Neutrofili

T-regulatory cells (Tregs) La tolleranza periferica T-cellulare è un processo immunologico dimostrato nell’autoimmunità, nel cancro, nelle infezioni, nei trapianti e nelle allergie. E’ stata individuata una famiglia eterogenea di cellule T ad attività regolatoria (Treg) che giocano un ruolo chiave nella tolleranza periferica. Si tratta di popolazioni di cellule T sia naturali che inducibili diverse tra loro nello sviluppo, specificità, meccanismi d’azione. Bluestone JA et al. Nat Rev Immunol 2003

T-regulatory (TReg) cells Subsets of regulatory T cells: CD4+CD25+Treg, Tr1, Th3, CD8+CD25+CD28-Treg, CD4-CD8-Treg, TCRgammadeltaTreg Suppressive factors involved in pheripheral tolerance to allergens IL-10, TGF-beta, CTLA-4, GITR, PD-1, HR2 Specific effector cells Jutel et al., Allergy 2006

Tr1 cells Sono coinvolte nella tolleranza periferica T-cellulare essendo capaci di re-direzionare una risposta immune inappropriata verso allergeni o autoantigeni. Possono essere indotte dalla presenza di IL-10 prodotta da cellule dendritiche immature ed utilizzano vari meccanismi soppressivi, primi tra tutti la produzione di IL-10 ed in minor misura di TGF-beta Taylor A et al., Immunology 2006 Levings MK et al., Blood 2005 Th3 cells Sono caratterizzate da una prevalente produzione di TGF-beta e da una minore produzione di IL-10 dopo attivazione con determinati antigeni La produzione di TGF-beta induce un incremento di IgA e dà una spiegazione del ruolo di queste cellule nel contesto dell’immunità periferica mucosale verso gli antigeni nei soggetti sani Jutel et al. Eur J Immunol 2003

CD4+CD25+Treg cells Originano dal timo, esprimono FOXP3, GITR, CD103 e CD122 ed agiscono soprattutto mediante meccanismi da contatto che coinvolgono CTLA-4, TGF-beta di membrana e PD-1, anche se rilasciano citochine (IL-10 e TGF-beta) Prevengono risposte patologiche verso antigeni self e not self ed i fenomeni autoimmuni; la loro deplezione porta allo sviluppo di malattie autoimmuni nei topi; nell’uomo la loro presenza è ridotta nelle malattie autoimmuni; sopprimono le risposte immuni ai tumori Read S et al. J Immunol 2006 Shimizu J Nat Immunol 2002 Bluestone JA et al. Nat Rev Immunol 2003

IL-10: azioni sulle cellule del S.I. TReg cells APC Eosinophil Inibizione capacità presentazione antigenica Inibizione produzione citochine/sopravvivenza Inibizione produzione citochine/attivazione Switch isotipico  rapporto IgG4/IgE IL-10 Mast cell B cell Soppressione risposta all’allergene (tramite inibizione del CD28) Inibizione produzione citochine/attivazione Induce la proliferazione delle Treg (loop autocrino) Th2-Th1 Basophils TReg cells

Soppressione risposta TGF-beta: azioni sulle cellule del S.I. TReg cells Down-regolazione espressione Fcepsilon RI Cellule B Soppressione IgE Induzione IgA Langerhans TGF-beta Induzione della generazione di Th17 Soppressione risposta all’allergene Induce la proliferazione delle Treg Th2-Th1 Th17 TReg cells

T cell APC Signal 1 Signal 2 Activation signal 2 CD28 CD4 TCR/CD3 complex Signal 1 Signal 2 MHC Class II Antigen B7 (CD80 or CD86) APC

T cell costimulatory pathways modificato da Nat Reviews APC T cell CD80 CTLA-4 (CD152) CD86 CD28 CD40 CD40L (CD154) CTLA-4 Ha il 30% di omologia con CD28 ed e’ indotto rapidamente dopo attivazione delle T Utilizza gli stessi ligandi del CD28 (CD80/CD86) con affinità > 10-20 volte E’ un potente segnale inibitorio per le T cells, riduce il segnale per CD28 e TCR, inibisce l’espressione di IL-2 e IL-2R e blocca le cellule T in fase G1 CD28 Costitutivamente espresso dalla maggioranza dei T CD4+ e dal 50% dei T CD8+ ed ha come ligandi CD80 e CD86 Promuove la differenziazione delle T cells in T helper Può fare da signaling alle DCs mediante CD80 e CD86 Controlla sviluppo timico ed omeostasi periferica delle Tregs

Treg APC T cell Azioni favorevoli Azioni sfavorevoli Inhibition Omeostasi comparto T cell Prevenzione Autoimmunità Tolleranza ai trapianti Prevenzione GVHD Prevenzione allergie Azioni sfavorevoli Down-regulation delle risposte immuni ai tumori Down-regulation delle risposte immuni alle infezioni Treg Inhibition Inhibition APC T cell CD80 CTLA-4 (CD152) CD86 CD28 CD40 CD40L (CD154) modificato da Nat Reviews

Altre sottopopolazioni regolatorie IL-10-producing regulatory B cells: sono cellule capaci di azione tollerogena mediante produzione di IL (come la IL-10) o l’interazione con T effettrici in modelli murini di artrite reumatoide, encefalomielite ecc. Mizoguchi A et al. J Immunol 2006 Dc-Regs: sono cellule dendritiche che agiscono come regolatori delle risposte immuni infiammatorie mediante la produzione di IL-10 (esistono subsets naturali: CD11 (lowCD45RB(high)DCs) Fujita S et al. Blood 2006 Macrophage 2 (M2): “alternatively activated macrophages”, hanno funzioni immunoregolatorie e promuovono remodelling e riparazione tissutale Mantovani A et al. Blood 2006 Invariant NKT (iNKT): è un subset dei T linfociti che può sopprimere la immunosorveglianza delle CTL verso i tumori attraverso la produzione di citochine Terabe et al., J Exp Med, 2003

B1-Th1/Th17 B2-Treg Network Le B1 e B2 sono due distinte linee di cellule B che differiscono per locazione, espressione genica, repertorio anticorpale, risposte proliferative e secrezione immunoglobulinica Th1 (IFN-g, IL-2, TNF-a) Sembra che in tali azioni, le B1 e B2 siano più incisive delle DC B1 Th17 (IL-17, IL-21, IL-22) In presenza di TGF-b/ IL-2: Foxp3+CD4+ Treg cells B2 B1 implicate nelle risposte a microrganismi e tumori ma anche in fenomeni autoimmuni B2 implicate soprattutto in fenomeni regolatori Zhong X et al. Eur J Immunol 2007

IL-10-producing regulatory B cells Neutralizzazione di fattori solubili dannosi NKT cells CD8+Treg Soppressione attivazione di Dc/macrofagi Attivazione Riduzione attivazione CD4 per via diretta o tramite Dc CD1d Aumento clearance di cellule apoptotiche (sorgenti di auto-Ag) T CD4+ IgG/IgA Regulatory B cells TGF-b Inibizione presentazione ag e cascata infiammatoria IL-10 Apoptosi Regolazione bilancia citochine DC EffectorT cells Th1/2 cells Mizoguchi A, et al. J Immunol 2006

M1/T1-M2/T2-M17/T17 Network I macrofagi vengono sottoposti a varie forme di polarizzazione in base alla tipologia degli stimoli ambientali cui vengono sottoposti: M1(fenotipo IL-12high, IL-23high , IL-10low), indotti da IFN-gamma, LPS, TNF, GM-CSF, capaci di produrre citochine pro-infiammatorie (IL-1 beta, TNF, IL-6) e di indurre risposte polarizzate Th1 M17 (“Macrophage producing Th17-polarising cytokines”), ad attività polarizzante i Th naive in Th17 in seguito a stimolo da batteri extracellulari Boraschi et al. Eur Cytokine Netw 2006

M1/T1-M2/T2-M17/T17 Network M2 (fenotipo IL-12low, IL-23low , IL-10high), dotati di funzioni immuno-regolatorie ed in grado di promuovere remodelling e riparazione cellulare e di indurre prevalentemente risposte polarizzate Th2 Le cellule M2 sono state recentemente suddivise in 3 sottotipi in base agli specifici stimoli inducenti: - M2a indotte da IL-4 ed IL-13 - M2b indotte da immunocomplessi ed agonisti di IL-1R e TLR - M2c indotte da IL-10 e glucocorticoidi Mosca et al. J Leukoc Biol, 2007 Mantovani et al. Immunity, 2005

Dc Network Dc immatura Dc17 cells? ITS LPS Dc1 cells Dc reg cells Allergeni, elminti Dc1 cells Dc reg cells Dc2 cells Th1 cells Th2 cells Treg cells modificato da Till SJ, JACI 2004

SUBSET CITOCHINICO ATOPICI Norman PS, J Allergy Clin Immunol 2004 Atopici: prevalenza subset Th2 (secrezione prevalente di IL-4, IL-5, IL-9, IL-13) Romagnani S. et al. JACI 2000 Negli ultimi anni è stato osservato che anche le cellule Th1 hanno un ruolo importante nel corso delle malattie atopiche, agendo insieme alle Th2 nel mantenimento della flogosi allergica cronica Ngoc PL et al.Curr Opin Allergy Clin Immunol 2005

TH17, caratteristiche e rapporti con le allergie Le Th17 giocano un ruolo chiave nell’infiammazione e nell’autoimmunità: sono state associate all’asma, AR, LES, reazione di rigetto ai trapianti Th17 sono caratterizzate dall’espressione di: IL-17 (IL-17A), IL-17F, IL-6 TNF-a, IL-22, IL-21 Th17 Th17 nell’asma allergica L’espressione di IL-17 aumenta dopo challenge allergenico La sua concentrazione è elevata nel polmone e nel sangue dei pazienti allergici ed è legata alla severità dei sintomi Le Th17 hanno azioni regolatorie ed inibitrici nell’asma conclamato inibendo IL-5, eotassina, reclutamento degli eosinofili nell’asma

CHEMOCHINE ED ALLERGIE RESPIRATORIE Minciullo P.L., Patafi M., Giannetto L., Merendino R. A., Di Pasquale G., Morabito F., Pacchiano E., Ferlazzo B., De Luca G., Gangemi S. The CX3C-chemokine fractalkine (CX3CL1) is detectable in serum of patients affected by allergic rhinitis and/or asthma European Journal of Inflammation 2005; 3: 149-152 Gangemi S., Ruello A., Arena A., Minciullo P., Pirazzoli A., Di Blasi P., Purello-D'Ambrosio F., Merendino R.A. In vitro effect of fluticasone propionate on interleukin-8 production by monocytes obtained from patients affected by moderate-severe allergic asthma Pharmacology, 2002 Oct;66(2):57-60 Purello D'Ambrosio F., Gangemi S., Merendino R.A., Arena A., Lombardo G., Valenti A., Romano M. Fluticasone propionate reduces serum interleukin-8 levels in asthmatic patients Respiration, 2000; 67: 348

TOLLERANZA MATERNO/FETALE Tolleranza materna verso il feto Trofoblasto  IL-35  Treg  Th17  IL-35 Tolleranza materna verso il feto

IPOTESI IGIENICA,ALLERGIE,AUTOIMMUNITA’ Ipotesi igienica (tradizionale) Le infezioni rafforzano la risposta Th1. Miglioramento delle condizioni igieniche, vaccinazioni e stile di vita “occidentale” hanno portato alla riduzione delle comuni infezioni, favorendo lo switch Th1>Th2. Le allergie, pertanto, sono aumentate L’esposizione ad endotossine può esacerbare l’asma in soggetti con malattia già conclamata Braun-Farhlander C et al. NEJM 2002 I livelli di endotossine nella polvere domestica correlano inversamente con la sensibilizzazione allergenica Gereda JE et al. Lancet 2000 Hygiene Hypothesis In modelli murini è stato dimostrato che le endotossine sono protettive quando somministrate prima della sensibilizzazione allergica mentre esacerbano l’infiammazione bronchiale quando somministrate in animali sensibili

IPOTESI IGIENICA,ALLERGIE,AUTOIMMUNITA’ Malattie parassitarie inducenti risposte Th2 sono protettive quanto le endotossine batteriche Th1-inducenti Wills-Sharp M et al. Nat Rev Immunol 2001 E’ solo la promozione di risposte Th1 da parte delle infezioni a prevenire l’insorgenza di allergie ? Hygiene Hypothesis ragazzi infettati da schistosoma sono protetti dalle allergie,ma perdono questa protezione dopo terapia anti-elmintica Van den Biggelaar AH et al Lancet 2000 L’ipotesi igienica si può applicare solo alle allergie ? Le infezioni attivano il network regolatorio cellulare –citochinico Le infezioni riducono diabete giovanile,sclerosi multipla e M.di Crohn insieme alle allergie Bach JF NEJM 2002 Riduzione dei fenomeni allergici ed autoimmuni

VITAMINA D E SISTEMA IMMUNE Risposta Immune Vitamina D3 Allergie Risposta alle terapie

ADIUVANTI STIMOLANTI IL-10 INCREMENTANO L’EFFICACIA DELLA SLIT Dc Vit.D3 Vit.D3 T CD4+ naive Treg pre-trattate con Vit.D  efficacia SLIT Dc Lactobac. plantarum Dc T CD4+ naive Th1 Dc pre-trattate con L.plantarum Van Overtvelt L. et al. Int Arch Allergy Immunol 2007 IL-10 Dc Dc reg Tnaive Treg Vit.D3 ITS+ Vit.D3 La Vit.D3  l’efficacia dell’ITS mediante IL-10 e TGF-b Questa azione viene abrogata dall’aggiunta di Ab anti-IL-10 e anti-TGF-b BALB/C mice OVA-sensibili Taher YA et al. J Immunol 2008

SAg da Streptococco emolitico I SUPERANTIGENI INFLUENZANO LA RISPOSTA AGLI IMMUNOSOPPRESSORI NELLE MALATTIE AUTOIMMUNI Attivavano MEK/ERK Li et al. JACI 2004 Edmead et al. J Immunology 2004 Superantigeni Attivavano NFAT Koike et al. J Biol Chem 2003 L’attivazione di ERK è associata con la funzione di NFAT e la produzione di IL-2 nella fase ritardata dell’attivazione delle T SAg da Streptococco emolitico Riduce l’azione soppressiva del betametasone verso la proliferazione in vitro dei PBMC dei pazienti affetti da psoriasi e la sua efficacia terapeutica Riduce in vitro la produzione di IL-10 da PBMC dei pazienti psoriasici La vitamina D3 è in grado di ripristinare l’efficacia terapeutica del betametasone nei pazienti psoriasici Aiba S et al. Exp Dermatology 2002 Araki K et al. Eur J Pharmacol 2007

Alcune sequenze di DNA batterico (Immunostimulatory Oligodenucleotides o ISS-ODN) riconosciute dal TLR sulle APC, inducono una risposta Th1 inflammation PAMP Path.Ag.. Toll-like PRR IL-12 IL-18 Th1 CD80/CD86 CD28 Dendritic cell Ag Naive T cell MHC -II TCR Th2 da Medzhitov R, Nature Rev Immunol 1,135,2001

Toll-like receptors e: infezioni, allergia, autoimmunità e cancro batteri Gram+/-, miceti, virus RNA/DNA, protozoi Molecole associate a patogeni (PAMPs) TLRs riconoscono Molecole proprie dell’organismo Defensine, ROS, HMGB1, fibrinogeno, hsp, surfactante, EDN Possono essere coinvolti: danno tissutale malattie autoimmuni m.neurodegenerative m.allergiche e cancro Chen K et al. Int Immunopharmacol, 2007 TLR signaling

VITAMINA D E TOLL-LIKE RECEPTOR TLR2/6 TGF-b1 TLR2/1 CYP27B1 CYP27B1 Loop autocrino 25D3 1,25 D3 25D3 1,25 D3 TLR2 CD14 VDR VDR Cathelicidin Cathelicidin KERATINOCITA MONOCITA la carenza di Vit D è associata ad aumentata suscettibiltà alla TBC Attività anti-microbica diretta Induzione del rilascio di citochine e conseguente infiammazione la catelicidina è in grado di bloccare la sensibilizzazione in modelli murini di DAC La disfunzione della catelicidina è stata associata alla dermatite atopica e alla psoriasi Schauber J et al. J Clin Invst 2007 Schauber J et al. JACI 2008 Di Nrado A et al. J Immunol 2007

CONCLUSIONI Conoscenze ancora incomplete sul network citochinico coinvolto nella flogosi allergica Coinvolgimento di tutte le cellule del Sistema Immune e contemporanea cooperazione di più meccanismi insieme Ruolo centrale delle alterazioni della tolleranza periferica nei soggetti atopici Maggiori conoscenze sulla flogosi allergica potranno fornire nuovi target e strategie terapeutiche per le patologie allergiche