DIAGNOSI DI PARENTELA Estrazione del DNA La prima fase della diagnosi di parentela consiste nell'estrazione del DNA dai campioni biologici prelevati per l'esame ed è eseguita mediante l'impiego di protocolli riconosciuti ed approvati in ambito scientifico. Nel DNA il tratto in cui risiede l'informazione genetica, è definito gene, e la sua localizzazione sui cromosomi viene definita locus. Per ogni locus, un individuo eredita un allele dalla madre e un allele dal padre; se gli alleli ereditati sono uguali, l'individuo è omozigote, se sono diversi, l'individuo è eterozigote. Analisi dei campioni Il campione biologico dal quale sarà estratto il DNA è rappresentato da una goccia di sangue dell’animale da analizzare raccolta su una Card, specifica per ricerche genetiche opportunamente siglata con un codice identificativo dell’animale analizzato. Le Card saranno conservate ed analizzate con le modalità appropriate. Sarà costituita una banca dati sia di campioni di sangue su tali Card che del DNA estratto. Dopo l’estrazione del DNA, con una metodica specifica, sarà eseguita l’analisi dei microsatelliti, condotta mediante una reazione enzimatica di amplificazione del DNA, conosciuta come Polymerase Chain Reaction (PCR), che consente di amplificare in vitro una specifica regione del DNA copiandola in varie fasi successive, fino ad ottenerne milioni di copie, fino ad ottenerne una quantità idonea per l’esecuzione dell’esame. Una volta effettuata la PCR, sarà eseguita un’elettroforesi capillare, al termine della quale sarà possibile eseguire un’analisi di frammenti che fornirà il genotipo specifico dell’animale e permetterà, di eseguire dalla comparazione di differenti campioni, così tipizzati, un’analisi di parentela. Risultati del test di parentela I risultati del test di parentela saranno valutati attraverso il confronto tra le differenze nella sequenza di DNA del padre presunto, della madre presunta e dei figli. Normalmente, il classico test di parentela consiste nella valutazione dell'insieme delle caratteristiche che costituiscono il profilo genetico del singolo figlio e della madre presunta, se la madre presunta possiede nel suo profilo genetico queste caratteristiche risulta essere la madre biologica (attribuzione di maternità). Se al contrario, la madre presunta non possiede queste caratteristiche genetiche, egli sarà esclusa come madre biologica (esclusione di maternità). Tutte le caratteristiche genetiche del figlio che non sono presenti nella madre devono essere state obbligatoriamente ereditate dal padre biologico. Se il padre presunto possiede nel suo profilo genetico queste caratteristiche risulta essere il padre biologico (attribuzione di paternità). Se al contrario, il padre presunto non possiede queste caratteristiche genetiche, egli sarà escluso come padre biologico (esclusione di paternità). In pratica, se il profilo genetico del figlio, della madre e del padre presunto differiscono per due o più caratteristiche genetiche l'ESCLUSIONE è certa (0% di probabilità di essere il padre e/o madre biologico). Al contrario, se il profilo genetico del figlio e del padre presunto concordano per ogni caratteristica genetica analizzata, si ottiene un’ATTRIBUZIONE della paternità, lo stesso vale per la madre.

Con la Card si possono raccogliere e archiviare i campioni di sangue fresco e/o campioni di sangue trattato con anti-coagulanti (per esempio EDTA, citrato o eparina). Il campione di sangue può essere trasferito sul cerchio con una pipetta o direttamente assorbendo il sangue da una puntura sulla pelle inflitta da una lancetta. Prestare attenzione di non sovraccaricare il cerchio; il livello del campione non deve superare di molto la linea del cerchio. Commenti importanti: 1. L’area di raccolta del campione è igroscopica; togliere la Card dalla confezione solo al momento dell’utilizzo. La Card – sia prima, sia dopo il campionamento – deve essere mantenuta essiccata. 2.Non toccare mai l’area di raccolta del campione con le mani; manipolare la Card sempre con guanti sterili altrimenti lavarsi bene le mani prima del campionamento, l’uso scorretto può falsare i risultati dell’analisi o renderla impossibile. 3.Ogni campione biologico deve essere considerato potenzialmente infetto; pertanto rispettare le comuni norme di sicurezza. MANUALE D’USO DELLA CARD - Possono essere conservati sulla VET Kard campioni di sangue raccolti direttamente con un semplice PRELIEVO ENDOVENOSO, oppure cercare una piccola vena sull’orecchio o pungere sul labbro (in questo caso evitare di eseguire il prelievo dalla bocca di un cucciolo dopo una poppata perché il latte residuo potrebbe aver DNA materno), procedere come segue: - Etichettare le VET Kard con un appropriato identificativo del campione. - Depositare 2 o 3 gocce di sangue (circa 100 μl) nella zona centrale della Kard, evitando di eccedere nella quantità di sangue depositata. - Lasciare asciugare i campioni a temperatura ambiente. Non scaldare per cercare di ottenere un’asciugatura più rapida, in quanto ciò potrebbe fissare gli inibitori della PCR sulla matrice della Kard (I punti su cui il sangue è asciutto appariranno più scuri rispetto a quelli su cui il sangue è appena stato depositato). - Mettere la Kard nel sacchetto con la bustina piccola di plastica trasparente con essiccante, il tutto richiudere nella busta di plastica trasparente ed il tutto nella busta grande bianca filigranata, e conservare in un ambiente fresco e asciutto a umidità controllata.

Lasciare asciugare le Card a temperatura ambiente (non applicare asciugatura forzata, tipo calorifero o altra fonte di calore). Inviare i campioni presso l’ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE N.B. I campioni possono essere conservati e trasportati a temperatura ambiente. Non mettere i campioni in buste di plastica senza sali, perché questo potrebbe impedire la loro completa asciugatura. Contenuto del kit fornito dall’Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno, SPEDITO o RITIRATO presso la nostra sede più vicina : Card* Buste per i campioni* Modulo di registrazione dei campioni* Manuale d’uso* * Il numero varia a secondo della Vostra richiesta L’Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno, con sede centrale in Portici (NA) e sezioni periferiche in quasi tutte le province della Campania e della Calabria, è uno dei 10 Istituti Zooprofilattici presenti in Italia; fa parte di una rete estesa sull’intero territorio nazionale che include gli istituti di Brescia, Foggia, Padova, Palermo, Perugia, Roma, Sassari, Teramo e Torino. L’IZSM ha adottato un Sistema Qualità secondo la UNI CEI EN ISO/IEC 17025 ed è stato riconosciuto ed accreditato dall’Istituto Superiore di Sanità-ORL (Organismo di Riconoscimento dei Laboratori) nel dicembre 2000 come “conforme alla norma europea UNI CEI EN ISO/IEC 17025 ed a quant’altro previsto dall’art. 3 del D. Lgs. 26 maggio 1997, n. 156”. L’IZSM è iscritto nell’Elenco dei laboratori riconosciuti al numero NR 0001. L’IZSM è socio dell’International Society for Animal Genetics (ISAG) partecipa alle prove valutative interlaboratorio (ISAG comparison test) L’IZSM si impegna a conservare presso i propri laboratori, in condizioni sicure ed ottimali, i campioni pervenuti dalle Società affiliate all’E.N.C.I. Si impegna a non eseguire, su cani iscritti ai Registri Genealogici tipizzazioni del DNA per conto di persone e/o ditte e/o Enti diversi dall’E.N.C.I. e dall’Associazione di razza. L’E.N.C.I. resterà titolare dell’archivio dei campioni biologici depositati e dei risultati ottenuti dall’analisi.