CINETICHE ENZIMATICHE METODI DI MISURA DELLE CINETICHE ENZIMATICHE

LO STUDIO DELLA CINETICA ALLO STATO STAZIONARIO NON DA MOLTE INFORMAZIONI SUL MECCANISMO DI REAZIONE Allo stato stazionario possiamo solo misurare il flusso in uscita o in entrata, i quali sono uguali tra loro. Possiamo comunque ottenere alcune informazioni sul meccanismo di reazione variando le condizioni sperimentali (dipendenza dal pH)

LO STUDIO DELLA CINETICA RAPIDA DELLE REAZIONI PUO’ DARE IMPORTANTI INFORMAZIONI SUL MECCANISMO DI REAZIONE E + S EX EY EZ  E + P

(RAPID MIXING)

Tecniche di mescolamento rapido: Il metodo del flusso continuo (1923 – H. Hartridge and F.J.W. Roughton) 1 ms 10 m/s 1 cm Tempo morto (dead time) Tempo massimo (upper time limit)

Spettrofotometro a flusso continuo Tempo morto = 45 s Tempo massimo = 1 ms)

Spettrofotometro a flusso interrotto Il metodo del flusso interrotto 1934 – F.J.W. Roughton 1940 B. Chance 50 -200 L Spettrofotometro a flusso interrotto Tempo morto = 2 ms Tempo massimo = NO

Il metodo del flusso “smorzato” chimicamente

Flash photolysis 1959 Q.H. Gibson Flash at 347 nm ATP “ingabbiato”

Tecniche di rilassamento: Salto di temperatura o di pressione Rate constant = 1/relaxation time (0.721)

Tecniche di rilassamento: Perturbazioni sinusoidali dell’equilibrio tramite ultrasuoni

 = kon koff [S]>>[E]

E + S EX EZ  E + P

STOPPED-FLOW DIODE ARRAY

SAGGI DI ATTIVITA’ ENZIMATICA Gli enzimi possono essere usati come strumenti analitici per identificare o quantificare sostanze chimiche specifiche in soluzione. E’ possibile determinare la presenza e la quantità di un determinato enzima in un fluido biologico misurandone l’attività con substrati specifici. Possiamo determinare i parametri cinetici (KM , Kcat o attività specifica) di un particolare enzima. CONDIZIONI SPERIMENTALI DEL SAGGIO Controllo del pH con una soluzione tampone Controllo della temperatura Assenza di inibitori (agenti chelanti, metalli) { CONTINUI SAGGI DI ATTIVITA’ DISCONTINUI o A PUNTI FISSI In un saggio di attività enzimatica noi misuriamo il prodotto della reazione, più di rado misuriamo il consumo di substrato.

E + S  E + P (prodotto colorato - cromoforo SAGGI CONTINUI Sono più accurati e meno laboriosi di quelli discontinui Per lo più usano metodi spettrofotometrici SAGGI DIRETTI E + S  E + P (prodotto colorato - cromoforo o fluorescente – fluoroforo) Esempio: + NADH Piruvato Lattato Deidrogenasi (LDH) + NAD+ Lattato

E1 + S  E1 + P (prodotto non colorato o fluorescente) SAGGI ACCOPPIATI E1 + S  E1 + P (prodotto non colorato o fluorescente) E2 + P  E2 + Q (secondo prodotto, Q, colorato) L-treonina aldolasi Esempio: + L-treonina glicina acetaldeide alcol deidrogenasi + NADH + NAD+ acetaldeide alcol etilico

[Etot] = 0,13 mM Vmax = 26  0,3 mM min-1 KM = 0,19  0,01 mM kcat = Vmax / [Etot] = 26 / 0,13 = 206 min-1

SAGGI DISCONTINUI Alcuni sistemi non possono essere saggiati in modo continuo Perché durante la reazione non si formano o consumano cromofori o fluorofori e le condizioni per far sviluppare colore o fluorescenza sono diverse da quelle del saggio. Non è possibile far sviluppare colore o fluorescenza. La misura del prodotto (o del substrato consumato) devono essere fatte con altri sistemi, ad esempio HPLC, saggi biologici o immunologici. Presenza di un fondo ( background ) elevato; ad esempio di assorbanza dovuta alle proteine in un estratto crudo o di altre molecole che assorbono alla lunghezza d’onda che a noi interessa. In questo caso dobbiamo condurre il saggio e poi eliminare la fonte di disturbo.

ESEMPI DI SAGGI DISCONTINUI PRELIEVO DI ALIQUOTE AD INTERVALLI DI TEMPO ENZIMA + SUBSTRATO REAZIONE IN CORSO La reazione viene bloccata con acido, denaturanti delle proteine, calore, inibitori dell’enzima Il prodotto di reazione viene quantificato con vari metodi E1 + S  E1 + P P-X metodi colorimetrici Quantificazione con HPLC Trasformazione in un composto che può essere quantificato colorimetricamente o in altro modo 1a FASE 2a FASE X E2 Metodi radioisotopici

Esempio: 1a FASE Glutamato 1-semialdeide (GSA) 5-aminolevulinato (ALA) 2a FASE GSA + DMBA     COMPOSTO COLORATO

Metodi radioisotopici Si basano sull’utilizzo di forme radiomarcate di un substrato Sono metodi molto sensibili ma limitati alle applicazioni in cui è possibile separare facilmente i substrati dai prodotti Esempio: misura dell’attività di un’aminotrasferasi + 1a FASE Miscela di reazione lavaggio eluizione Conteggio radiattività 2a FASE (separazione cromatografica e conteggio della radiattività) colonna cromatografica a scambio anionico aminoacidi chetoacidi

{ { INATTIVAZIONE DEGLI ENZIMI REVERSIBILE IRREVERSIBILE E + P1  COMPETITIVA INCOMPETITIVA MISTA REVERSIBILE { ASPECIFICA PER IL TIPO DI ENZIMA BASATA SUL MECCANISMO DI REAZIONE DELL’ENZIMA (inibitori suicidi) IRREVERSIBILE E + P1  E + I EI    E + P2 EX EY

La parete batterica contiene D-aminoacidi (D-alanina ad es La parete batterica contiene D-aminoacidi (D-alanina ad es.) come costituenti dei ponti polipeptidici che connettono le catene di carboidrati. Questi vengono ottenuti dagli L-aminoacidi tramite reazioni di racemizzazione (catalizzate da racemasi). In alcuni batteri, il D-glutammato che viene incorporato nella parete batterica non è sintetizzato per racemizzazione ma tramite una reazione di transaminazione: D-alanina + a-chetoglutarato  piruvato + D-glutammato Questa reazione è catalizzata da un enzima dipendente dal piridossal fosfato: la D-aminoacido aminotrasferasi

+ E-PLP + INTERMEDIO AMINOACRILATO D-b-cloroalanina (inibitore) Il Cloro è un buon gruppo uscente nelle reazioni di sostituzione nucleofila + E-PLP D-alanina (substrato naturale) INTERMEDIO AMINOACRILATO Verso l’inibizione + Normale reazione di transaminazione

MECCANISMO DI INATTIVAZIONE INTERMEDIO AMINOACRILATO ENZIMA INATTIVATO

La VIGABATRINA: un farmaco contro l’epilessia. L’acido g-aminobutirrico (GABA) è uno dei principali neurotrasmettitori inibitori del sistema nervoso centrale glutammato decarbossilasi L-glutammato GABA + + GABA aminotrasferasi GABA a-chetoglutarato Succinico semialdeide L-glutammato

L’epilessia può essere trattata aumentando la concentrazione di GABA nel sistema nervoso centrale. Un metodo per ottenere questo risultato è quello di inibire in modo specifico la GABA aminotrasferasi GABA 4-amino-5-esanoato VIGABATRINA La VIGABATRINA, un analogo del GABA, è un efficiente inibitore della GABA aminotrasferasi ed è attualmente utilizzata con successo nel trattamento dell’epilessia

MECCANISMO DI INIBIZIONE DELLA VIGABATRINA 75% ENZIMA INATTIVATO 25%

a-difluorometilornitina L’EFLORNITINA: un farmaco contro la malattia del sonno L’ornitina decarbossilasi è un enzima essenziale per la produzione della putrescina, un precursore delle poliamine + E-PLP ornitina a-difluorometilornitina o eflornitina + E-PLP putrescina

MECCANISMO DI INIBIZIONE DELL’EFLORNITINA ENZIMA INATTIVATO