Ruolo della Struttura della Cromatina nella Regolazione Genica Struttura della Cromatina nelle sequenze codificanti del gene. Struttura della Cromatina nel promotore. Ruolo del nucleosoma nel bloccare l’accesso al promotore. I nucleosomi possono essere spostati?

Fibre di Cromatina Fibra cromatinica da 30nm Fibra cromatinica da 10nm (collana di perle) + N-Termini carichi (legano il DNA di nucleosomi adiacenti) Istoni core altamente acetilati (specialmente H3 ed H4) Alti livelli di istone H1 Trascrizione OFF Ridotti livelli di istone H1 Trascrizione ON

DOMINI CROMATINICI EUCROMATINA: Cromatina decondensata, trascrizionalmente attiva. Replicazione precoce. Iperacetilazione degli istoni Ricca in metH3K4, 36 e 79 Geni eucromatici sottoposti a silenziamento sono ricchi in: meH3K9, 3meH3K27, meH4K20

ETEROCROMATINA: Cromatina altamente compattata e silenziata trascrizionalmente. Replicazione tardiva. Ipoacetilazione degli istoni Alti livelli di metilazione. Costitutiva: adiacente al centromero e contenente grandi blocchi di ripetizioni Alpha Satellite nell’uomo (Major Satellite repeats in topo) Silenziata irreversibilmente Ricca in 3meH3K9 + meH3K27 + 3meH4K20 Facoltativa: E’ silenziata reversibilmente e può tornare ad essere attiva (Esempio: cromosoma X femminile) Ricca in 2meH3K9 + 3meH3K27 + meH4K20

Relazione tra stato della cromatina ed espressione genica Regola generale: L’organizzazione nucleosomale nelle regioni a monte dei geni è correlata negativamente con l’espressione dei geni a valle. L’attivazione genica si correla di solito con una riduzione dell’occupanza nucleosomale nei promotori. Studi di Epigenetica hanno dimostrato anche il contrario. La cromatina può adottare diverse conformazioni con proprietà biochimiche e biofisiche distinte. Regioni genomiche diverse mostrano differenze nella compattezza globale e nell’accessibilità ad enzimi modificanti.

Studi fatti sulla frazione di cromatina “aperta” isolata da cellule e analizzata con microarrays hanno mostrato che: Esiste una correlazione tra cromatina aperta e densità genica es.: sui cromosomi 17, 19 e 22, più ricchi di geni e di cromatina aperta, si forma un loop decondensato nel nucleo interfasico MA 2) Non c’è sempre correlazione tra stato aperto della cromatina e livelli di espressione genica I GENI POSSONO A VOLTE ESSERE ATTIVI NELLE REGIONI CONDENSATE E INATTIVI NELLE REGIONI DECONDENSATE

HS = Siti di ipersensibilità alla DNasi I I siti ipersensibili alla DNasi I sono circa 100 volte più sensibili a questo enzima di un normale sito cromatinico Quasi ogni gene attivo contiene un tale sito di ipersensibilità, a volte più di uno, nella regione del promotore In SV40 si ha un’interruzione nell’organizzazione nucleosomica visibile al microscopio elettronico di circa 350bp che corrisponde alla regione di ipersensibilità

SITI IPERSENSIBILI ALLA DNasiI Possono rappresentare: Regioni occupate contemporaneamente da istoni e fattori di trascrizione – MMTV Regioni dove gli istoni sono stati rimossi dal DNA- geni per la β-globina, SV40

Problema importante: Come avviene l’esclusione dei nucleosomi dalle regioni Ipersensibili? Ipotesi: Il sito ipersensibile viene riconosciuto da proteine specifiche che escludono la formazione del nucleosoma

Come si dimostra che i nucleosomi sono esclusi da una regione? Mappatura di siti ipersensibili alla DNasi I Nuclei isolati DNA nudo Si usano quantità molto piccole di DNAsi I in modo da avere solo circa un taglio per molecola Questo permette di tagliare solo il DNA nudo e non quello nucleosomale. La cromatina viene poi deproteinizzata RI RI Sonda Taglio con EcoRI, elettroforesi e blot.

Domini cromosomici definiti tramite la DNAsi I Eritrociti di pollo (cellule adulte): Un gene diventa suscettibile all’enzima nei tessuti in cui è maggiormente espresso. L’ipersensibilità definisce uno stato di predisposizione alla trascrizione.

Gli esperimenti con la DNasiI hanno permesso di definire e provare L’esistenza di DOMINI intesi come unità di trascrizione funzionali (che contengono geni attivi).

Tipicamente siti di ipersensibilità alla DNasi I sono riscontrati su sequenze regolative come gli ENHANCER e i PROMOTORI, ma anche su altri elementi più complessi LCR ISOLATORI Questi elementi delimitano e definiscono dei domini funzionali e presentano ipersensibilità piuttosto estesa alla DNasi I (a volte su regioni di parecchie Kb).

LCR: Locus Control Region LCR: è un cluster di siti ipersensibili alla DNAsi I scoperto nel locus genico delle β-globine e necessario per la loro espressione. Scoperto a causa dell’inattivazione di transgeni (globine) che mancano di queste sequenze. Tutti i siti devono essere presenti per l’attivazione, ma il loro effetto è cooperativo, la delezione di ognuno riduce debolmente la trascrizione del locus. Ogni gene è poi regolato ulteriormente dai propri controlli specifici, e questo dipende dai fattori di trascrizione gene-specifici di volta in volta attivi. La sua delezione ripristina la resistenza alla DNAsi I. Probabilmente funziona rendendo la cromatina di questa regione più aperta.

LOCUS CONTROL REGION (LCR) E’ un sito regolatore di legame al DNA lontano dal promotore indipendente dall’enhancer. Di solito lega sia fattori ubiquitari che tessuto specifici. Nel locus delle globine ogni sito HS contiene lo stesso tipo di siti di legame per gli stessi fattori di trascrizione. Rende un promotore attivo a prescindere dalla sua posizione nella cromatina. Funziona aprendo la struttura nucleosomale del promotore, in modo che i fattori possono legarsi. Parecchi loci presentano elementi LCR a delimitare i loro confini: b-globine umane, di pollo e di topo Locus Th2 delle citochine umane Locus GH (growth hormone; comprende GHN, CSA, CSB, CSL e GHV)

LCR funziona attraverso una specifica organizzazione cromatinica che viene stabilita durante la replicazione. E’ necessario che LCR sia in continua comunicazione con gli elementi regolativi del cluster, cioè con gli enhancer e promotori dei singoli geni E’ probabile che questo assetto cromatinico si formi quando ha luogo il differenziamento della linea eritroide. Il meccanismo prevede l’ancoraggio a proteine del “nucleoscheletro”. Probabilmente questo avviene tramite fattori che legano LCR e contemporaneamente fattori che legano gli enhancer dei singoli geni (GATA e motivi di legame CACC). Gli elementi regolativi vengono tutti ancorati e le sequenze interposte formano anse con un meccanismo diverso da quello che riguarda le anse formate sulla matrice nucleare. RF = Replication Factory

Come funziona l’elemento LCR? Acetylase Pol II Una delle possibilità è che siano coinvolti sistemi di rimodellamento della cromatina, associati ai punti di ancoraggio delle anse

CBP (CREB-binding protein- acetiltrasferasi) sull’LCR In topo: NF-E2 e GATA-1 reclutano CBP (CREB-binding protein- acetiltrasferasi) sull’LCR Si ha acetilazione sull’LCR e a valle fino al distale 3’HS1 32Kb In human Pit1- attivatore trascrizionale del locus presente su LCR e su promotore. Delezione di Pit1 porta a forte riduzione dell’acetilazione e dell’espressione di GHN

Tecniche recenti hanno mostrato la stretta associazione spaziale tra i siti HS e i geni trascritti Si tratta di un’associazione dinamica dipendente dallo stadio dello sviluppo Struttura cromatinica “predisposta” “attiva” ACH Fattori della linea eritroide contribuiscono alla formazione della struttura ACH EKLF (Erythroid kruppel-like factor) GATA-1 FOG-1 (friend of GATA)

Nel caso del locus Th2 sono i promotori a realizzare la struttura ad ansa. “predisposta” in tutte le cellule della linea T solo in cellule T mature ed NK I fattori GATA-3 e STAT6 sono responsabili di questa struttura

Gli Isolatori: scs-scs’ – specialized chromatin structures Sono elementi che posti tra un enhancer e un promotore impediscono all’enhancer di agire sul promotore. Si può dire che delimitano un dominio. L’isolatore di Hsp70 in Drosophila lega un fattore BEAF-32 (di cui esistono due isoforme, A e B, prodotte per splicing alternativo) che viene evidenziato nelle interbande dei cromosomi politenici. Un’altra proteina che lega scs è SBP, sia in vitro che in vivo. Anche il sito HS4 dei geni della -globina di pollo è un isolatore. Hanno azione direzionale (vedi il trasposone gipsy di Drosophila). Posti tra un gene attivo e l’eterocromatina schermano il gene dall’azione silenziatrice dell’eterocromatina.

Proteine che agiscono sull’Isolatore gypsy su(Hw): mutazioni in questo gene aboliscono la capacità isolativa. L’isolatore di gipsy contiene 12 siti di legame per su(Hw). mod(mdg4): mutazioni di questo gene aumentano l’efficienza dell’isolatore, ma esso perde la direzionalità. Interagisce con su(Hw) e impone direzionalità alla capacità di su(Hw) di svolgere la funzione isolatrice.

Modelli di isolamento Il modello dei domini lega l’organizzazione fisica del cromosoma con le caratteristiche funzionali dell’isolatore. L’isolatore delimita un dominio che favorisce l’interazione produttiva di elementi all’interno del dominio ma preclude l’interazione con elementi al di fuori di esso.

Trascrizione della cromatina Un’idea su come possa funzionare: Girando intorno a un DNA-loop Studitsky, Clark, Felsenfeld Cell 76, 371 (1994)

Il Nucleosoma può bloccare l’accesso all’apparato trascrizionale Esperimenti di Roeder mostrano che il nucleosoma può bloccare TBP, fattori e polimerasi II. DNA usato è quello di Adenovirus. TATA TATA Fattori e pol II aggiunti prima, poi gli istoni Nucleosomi aggiunti prima di TFIID, fattori e pol II + + TATA II TATA II Trascrizione Nessuna trascrizione Questo può avvenire in seguito alla replicazione

DNA 5S + TFIIIA → TRASCRIZIONE In un altro esperimento in vitro: DNA 5S + TFIIIA → TRASCRIZIONE Successiva aggiunta di ottameri istonici NON spiazza il fattore di trascrizione DNA 5S + ISTONI → + TFIIIA NESSUNA TRASCRIZIONE Questo è stato chiamato MODELLO DELL’ACCAPARRAMENTO

ESISTE ANCHE UN MODELLO DINAMICO Anche questo modello è formulato sulla base di esperimenti in vitro. PROMOTORE DI Hsp70 di Drosophila DNA + fattore GAGA Nel promotore inizialmente nucleosomizzato, appare una regione di ipersensibilità alle nucleasi. QUESTO AVVIENE ANCHE DOPO LA FORMAZIONE DEI NUCLEOSOMI LA REGIONE DI IPERSENSIBILITA’ (probabilmente più libera dai nucleosomi) METTE IN FASE I NUCLEOSOMI ADIACENTI

STABILITA’ DEI SITI IPERSENSIBILI ALLA DNAsiI FIBROBLASTI DI POLLO TRASFORMAZIONE CON UN VIRUS ts CRESCITA A TEMPERATURA PERMISSIVA espressione delle globine comparsa dei siti ipersensibili PASSAGGIO A TEMPERATURA NON PERMISSIVA disattivazione delle globine i siti ipersensibili permangono per circa 20 generazioni e poi scompaiono Esistono meccanismi per l’instaurazione dell’ipersensibilità e per il suo mantenimento?

Analisi sulla struttura nucleosomale su larga scala in lievito ha rivelato Numerose ORF e promotori di geni repressi hanno nucleosomi ben posizionati. Quasi tutti i geni hanno DHS (siti ipersensibili alla DNasi) nei promotori a prescindere dallo stato trascrizionale dei geni stessi. LA PRESENZA DI DHS RIFLETTE “COMPETENZA” TRASCRIZIONALE PIU’ CHE “ATTIVITA’” TRASCRIZIONALE