XXXIII Ciclo del Dottorato di Ricerca in Medicina materno-infantile, Pediatria dello Sviluppo e dell’Educazione, Perinatologia STUDIO dei FENOMENI APOPTOTICI negli SPERMATOZOI e CORRELAZIONE con i PROCESSI di CAPACITAZIONE e FAGOCITOSI Relazione I anno Dottoranda Stefania Luppi 29 Settembre 2008

APOPTOSI FERTILITA’?? Fagocitosi corpi apoptotici SENZA infiammazione Morte cellulare programmata Ruolo essenziale nel CONTROLLO NUMERO CELLULE GERMINALI Lee et al. 1997 Spermatogenesi: PERDITA di circa il 75% del pot. numero di spz maturi Dunkel et al.1997 Rottura equilibrio = DIFETTI MATURAZIONE FERTILITA’??

Il SISTEMA Fas/FasL Sakkas et al., 1999, 2002 GERM CELL SERTOLI FasL Fas DD Sakkas et al., 1999, 2002 Individuata via di segnalazione Fas in spz EIACULATI M con parametri liquido seminale anormale: % spz Fas+ “APOPTOSI ABORTIVA” In alcuni casi di INFERTILITA’ compromissione di mecc. apoptotici durante spermatogenesi, percui Spz Fas+ NON vengono eliminati.

Dati i risultati contrastanti presenti in letteratura Soggetti normo- e non normo-zoospermici Fas presente su membrana LEUCOCITI Dati i risultati contrastanti presenti in letteratura è da chiarire la presenza o meno di Fas su spz eiaculati

RIDUZIONE dell’INTEGRITA’ di MEMBRANA Molto frequente in SOGGETTI INFERTILI Ricci et al.,2002; Glander et al.,1999 Evento PRECOCE di apoptosi Perdita asimmetria PL di membrana Traslocazione Fosfatidil-Serina (PS) Legame AnnessinaV fluo (AV) - PS Spermatozoi: vitali (AV-/PI-) apoptotici (AV+/PI-) necrotici (AV+/PI+) ec FACS + PI ic

Syto-16 / 7-AAD (7-Amino-Actinomycin-D) lega DNA cell vive/apoptotiche penetra in cell necrotiche FACS Spermatozoi: vitali (Syto-16++) apoptotici (Syto-16+) necrotici (Syto-16-/7-AAD+) Perticarari et al., 2007

e INDICE APOPTOTICO spz LEUCOCITI e APOPTOSI Potenziale enorme di interazioni tra leucociti e sist.riproduttivo Ruolo leucociti nel liquido seminale non ancora spiegato Correlazione LEUCOCITI spz e INDICE APOPTOTICO spz in soggetti normo- e NONnormo-zoospermici Ricci et al., 2002 Funzione cellulare fisiologica dei leucociti, in assenza di infez., responsabili di RIMOZIONE SPZ APOPTOTICI migliorando la qualità del seme. moAb anti-CD45 FACS [ ] leuco: monociti linfociti PMN

FAGOCITOSI degli SPZ APOPTOTICI a. In mammiferi dopo INSEMINAZIONE una grande q di spz viene rimossa attraverso FAGOCITOSI da parte delle cellule del tratto genitale Suarez et al., 2002; Pandya e Cohen, 1985 b. FECONDAZIONE avviene SOLO in seguito a CAPACITAZIONE degli spz nel tratto genitale In app genitale dopo richiamo LEUCOCITI per chemotassi, inducono APOPTOSI spz post-capacitati che NON hanno fertilizzato l’ovocita, a cui segue la FAGOCITOSI senza reaz infiammatoria.

OBIETTIVI della RICERCA: Studio dell’APOPTOSI degli spz, in condiz. fisiologiche e dopo capacitazione in vitro: - diversi marker dell’apoptosi - in pz normo- e NONnormo-zoospermici Metodiche: AV/PI; Syto-16/7-AAD in FACS Analisi del SISTEMA Fas/FasL negli spz, in condiz. basali e dopo capacitazione in vitro e nei leucociti Metodiche: moAb fluoresceinati anti-Fas in combinazione con il FACS moAb fluoresceinti anti-CD45 Definire il ruolo dei LEUCOCITI in rapporto all’apoptosi e alla rimozione degli spermatozoi Metodica: moAb fluoresceinati anti-CD45 in FACS

….. Confermare il risultato di altri studi in cui si è dimostrato che, se indice apoptotico spz è > 40%, si riscontra < prob di gravidanza e > prob di aborti spontanei in seguito a tecniche di PMA (IUI, FIVET) 5. Analisi del processo di FAGOCITOSI degli spz in condizioni basali e dopo capacitazione in vitro in pz normo- e NONnormo-zoospermici: - anomalie nella fagocitosi in casi di INFERTILITA’ di COPPIA - > suscettibilità di spz di maschi infertili ad essere fagocitati Tali informazioni fornirebbero una possibilità in più per la diagnostica delle infertilità e una possibile chiave di intervento per il loro trattamento.

RISULTATI PRELIMINARI Allestito test citometrico per verificare CAPACITA’ di FAGOCITOSI degli spz da parte di MACROFAGI (FACS) Risultati confermati con MICROSCOPIA OTTICA A FLUORESCENZA Phrodo succinimydil ester 2) Suscettibilità spz ad essere fagocitati PRIMA e DOPO CAPACITAZIONE in vitro Fagocitosi può favorire RIMOZIONE spz meno efficienti Spz non colorati Spz non cap pHrodo Spz cap pHrodo

AMPLIARE CASISTICA per verificare se questa differenza è correlata 3) Differenza dovuta a ≠ espressione di molecole di spf come C1q (macrofagi) e C1qR (spz) NON CAP CAP (mp) NON CAP: moAb anti-C1qR clone 74, clone 60 CAP: moAb anti-C1qR clone 74, clone 60 AMPLIARE CASISTICA per verificare se questa differenza è correlata a ≠ fagocitosi da parte dei macrofagi e comprendere se e come le 2 tecniche di capacitazione in vitro (MP e SU) possano influire su tale meccanismo.