in fase post diauxica in S. cerevisiae” Facoltà di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali Corso di Laurea triennale in Scienze Biologiche ELABORATO FINALE “Utilizzo della Real Time PCR per analizzare l’ espressione dei geni indotti in fase post diauxica in S. cerevisiae” Candidata: Relatore interno: Fabiana Pasquali Prof. Rodolfo Negri 1228524 Anno accademico 2014-2015

STRUTTURA ED ULTRASTRUTTURA DELLA CROMATINA Il nucleosoma è l’unità fondamentale della cromatina 10-80 cp È composto da: Un ottamero proteico: un tetramero centrale formato da due istoni H3 e due istoni H4, più Una coppia di dimeri H2A-H2B uno sotto e uno sopra. Circa 146 pb di DNA avvolgono due volte l’ ottamero proteico.

RIMODULAZIONE DELLA CROMATINA E MODIFICAZIONI CHIMICHE DEGLI ISTONI Al fine di consentire l’ espressione genica, è necessario che il DNA sia accessibile all’ RNA polimerasi e ad altre proteine. Ciò è reso possibile grazie a: - Rimodellamento dei nucleosomi Modificazioni covalenti del DNA e degli istoni (codice istonico)

Le modificazioni post-traduzionali e il codice istonico Le modifiche sono apportate da fattori proteici (writers),che possono essere più o meno specifici per un residuo istonico e sono rimosse da altri fattori proteici (erasers). - Le modifiche vengono lette da appositi fattori (readers) H1-H2B cis H2A-H2B Effetti delle modifiche post traduzionali trans

Senza dominio SET: DOT1 che metila K79 su H3 Metilazione Due le classi principali di HTM: ● le arginine metiltransferasi: metilano le arginine 2, 17 e 26 dell’ istone H3 e l’ arginina 3 dell’ istone H4 con dominio SET: metilano le Lys 4,9,27,36 di H3 e Lys 20 di H4 ● le lisine metiltransferasi : metilano le lisine Senza dominio SET: DOT1 che metila K79 su H3 Il donatore dei gruppi –CH3 è la S-adenosil-metionina (SAM)

Set1 Sei sono le lisine istoniche metilabili: H3K4, H3K9, H3K27, H3K36, H3K79 e H4K20, di queste, in S.cerevisiae solo tre lo sono. H3K4 ● è presente in tutti e tre gli stati di metilazione 5’ 3’ PAF1/ FACT Compass ● la metilazione in tutti e tre i casi è catalizzata da SET1

Demetilazione e Jhd2 ● JHDM ● LSD1 : amminossidasi nucleare riboflavina dipendente ● JHDM L’espressione di JHD2 è regolata dalla poliubiquitinazione catalizzata da Ube1, Ubc4 e Not4 (subunità di CCR4/NOT) In S.cerevisiae: - Jhd1 e Gis1 H3K36met1/met2 - Rph1 H3K36met2/met3 - Jhd2 H3K4met3

Ciclo vitale di Saccharomyces cerevisiae ● È un eucariote unicellulare, può esistere in uno stato aploide o diploide e si divide per gemmazione. ● può portare avanti due tipi opposti di metabolismo chemiorganotrofo fermentazione respirazione

SCOPO DELL’ ESPERIMENTO Ceppo di lievito: W303 Osservare e comprendere come varia la cinetica di repressione dei geni: IDP2 ● ODC1 Isocitrato deidrogenasi citosolica NAD+- dipendente Trasportatore della membrana mitocondriale interna Decarbossilazione ossidativa dell’ isocitrato ad α-chetoglutarato Trasporta l’α-chetoglutarato dalla matrice mitocondriale al citosol ● Geni della respirazione espressi durante il diauxic shift e ipermetilati. EP pellet DS pellet refresh Trattamento: -RS3195 -DMSO α-chetoglutarato JHD2 è inibita Fe2+ pellet:30’,1h,2h Estrazione RNA Reverse transcription RT-PCR

Real Time PCR COMPONENTI DELLA REAZIONE: DNA polimerasi Misura l’ amplificazione in tempo reale durante la fase esponenziale della PCR, quando cioè l’ efficienza di amplificazione è influenzata minimamente dalle variabili di reazione, permettendo di ottenere risultati molto più accurati rispetto alla PCR tradizionale. COMPONENTI DELLA REAZIONE: DNA polimerasi due oligonucleotidi dNTPs probe fluorescente DNA target 3 PASSAGGI: retrotrascrizione dell’ mRNA in cDNA amplificazione cDNA quantificazione QUANTIFICAZIONE : Assoluta Relativa ΔCtsample = Ct sample - Ct sample endogenous ΔCtreference = Ct reference - Ct reference endogenous ΔΔCt = ΔCtsample - ΔCt reference fold change = 2 – ΔΔCt FLUORESCENZA SYBR green sonde ad ibridazione

RISULTATI

Come giustifichiamo ciò? conclusioni Nel caso delle cellule trattate con RS3195 la cinetica di repressione di Idp2 e Odc1 risulta più lenta delle cellule trattate con il DMSO anche se il gene appare, comunque, represso dopo 2h. Come giustifichiamo ciò? Occorre capire se la demetilasi ha solo questo ruolo di modulare l’attivazione, se è proprio necessaria o se è solo una concausa. Per capire questo bisogna verificare se: 1) la quantità di RS3195 inoculata non è sufficiente a inibire completamente Jhd2, da verificare attraverso lavori di ChIP; a) se l’inibizione non è completa bisogna capire come inibirla completamente b) se l’inibizione fosse stata completa allora la metilazione non è il meccanismo principale dell’ attivazione ma ha un effetto secondario. 2) meccanismo a feedback negativo: