Effetti sul fenotipo dei diversi tipi di mutazione Mutazioni con perdita di funzione Quasi sempre sono Mutazioni recessive (genotipo in omozigosi): - l’eterozigote non esprime il fenotipo mutante, quindi senza aploinsufficienza (per meccanismi compensatori dell’altro allele?) con aploinsufficienza (pochissimi i casi di alleli recessivi che esprimono questo fenotipo) Mutazioni con acquisto di funzione In genere sono Mutazioni dominanti - per aumento della produzione proteica (e funzione) rispetto al wt - per produzione di una nuova proteina (e funzione) rispetto al wt

APPLICAZIONI DELLA TERAPIA GENICA - malattie ereditarie monogeniche con ereditarietà mendeliana malattie infettive - malattie multigeniche (cancro) Terapia genica classica: 1) Produzione e somministrazione della proteina che manca al paziente 2) Eliminazione delle cellule malate 3) Attivazione delle cellule del sistema immunitario che determinano l’uccisione delle cellule malate Terapia genica non convenzionale: Correzione del difetto genetico restaurando la normale espressione genica. 1) Inserimento completo del gene wt nelle cellule somatiche 2) Mutagenesi mirata nelle cellule somatiche per ripristino gene wt 3) Silenziamento nelle cellule somatiche del trascritto del gene mutato 4) Terapia genica nelle cellule germinali (solo in animali modello)

Strategie per la terapia genica somatica Aggiunta genica Correzione genica per mutagenesi mirata (gene targeting) Inibizione genica Eliminazione cellulare controllata Eliminazione cellulare mediata dal sistema immunitario

Terapia genica somatica in vivo ed ex vivo

Terapia genica somatica ex vivo Applicabile solo a certi tipi cellulari: cellule in divisione e coltivabili in vitro (es: da midollo osseo, pelle, tumori) In vivo: in situ 5

Terapia genica somatica ex vivo Estrazione/preparazione delle cellule primarie o della linea cellulare del paziente (cellule autologhe) - Trasferimento del gene in vitro - Quando possibile controllo dei trasformanti Reimpianto delle cellule nel paziente SVANTAGGI Applicabile a pochi tessuti (sistema emopoietico, cellule epiteliali, ecc) Tecnica difficile con scarsa efficienza Necessità di trattamenti ripetuti nel tempo Esempi: cellule staminali di midollo osseo trattate in emofilici e talassemici

Terapia genica somatica in vivo Introduzione diretta del gene in vivo nelle cellule bersaglio: iniezione diretta in tipi cellulari non coltivabili in vitro (es. c. cerebrali) o per aumentare il numero di cellule trattate rispetto alla terapia ex vivo (es. nel muscolo scheletrico distrofico) somministrazione in prossimità del tessuto bersaglio (ad es. vie respiratorie nella fibrosi cistica) Problemi: Trasferimento quantitativamente limitato Rischio di inserimento in cellule sane - Reazione immunitaria (alle proteine virali, se si utilizzano virus; talvolta alla proteina espressa)

METODI DI TRASFERIMENTO GENICO 1) Trasferimento genico diretto: trasfezione di DNA “nudo” in plasmidi (applicato a volte a cellule muscolari) trasfezione mediata da liposomi (vescicole formate da doppio strato lipidico) 2) Trasferimento tramite vettori retrovirus adenovirus virus adeno-associati 3) Tipi di inserzione: - ectopica - mirata

METODI DI TRASFERIMENTO GENICO Trasferimento genico diretto Vantaggi: - Non si generano nuovi virus patogeni - Riduzione del rischio di reazione immunitaria - Possono trasferire molecole di DNA anche molto grandi Svantaggi: - Scarsa efficienza sia di trasferimento che di integrazione - Se integrati, possibile mutagenesi inserzionale

METODI DI TRASFERIMENTO GENICO 2) Trasferimento tramite vettori virali Caratteristiche necessarie: - Le particelle virali ricombinanti devono essere difettive rispetto alla replicazione (deleti per geni responsabili di replicazione e assemblaggio del virione), non produrre composti tossici per l’ospite. Vantaggi: - Alta efficienza di trasferimento genico Svantaggi: - Espressione transiente - Possibilità di generare nuovi virus patogeni per ricombinazione con eventuali virus presenti nell’ospite - Inserzione di geni (o molecole di DNA) di dimensioni limitate - Mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in maniera casuale nel genoma) (attivazione di oncogèni) - Possibilità di reazioni immunitarie - Tecniche con bassa efficienza e costi elevati

Retrovirus (ad RNA): hanno specifici recettori per entrare nelle cellule; si integrano nei cromosomi in localizzazioni casuali, entrano nel nucleo solo quando si dissolve membrana nucleare (solo cellule in divisione) Adenovirus:  legame a specifici recettori cellulari che permettono l'ingresso del virus tramite endocitosi; infettano molti tipi cellulari, anche non in divisione; geni non integrati (episomi); espressione per brevi periodi; necessità di trattamenti ripetuti (es. trattamento fibrosi cistica) Virus adeno-associati (AAV): non sono in grado di replicarsi autonomamente ma necessitano di virus helper co-infettanti come adenovirus o Herpex simplex. Si integrano in sito specifico (19q13.3).

Vettore virale Vantaggi Svantaggi Retrovirus Capacità d'inserimento del gene, integrazione stabile nel DNA dell'ospite, elevati titoli di virus ricombinante, ampio tropismo d'infettività, relativa facilità di manipolazione del genoma virale Difficoltà nel controllare l'infezione virale, mancata infezione delle cellule non in divisione, integrazione a caso nel genoma dell'ospite Lentivirus Infezione delle cellule in divisione o meno, espressione stabile del gene, elevata capacità d'inserimento Mutagenesi potenziale presenza di sequenze proteiche regolatrici e accessorie Adenovirus Elevati titoli di virus, alta espressione genica, grande capacità d’infezione di cellule in divisione e non in divisione Risposte immuni alle proteine virali, nessuna integrazione nel genoma dell'ospite, espressione genica transitoria Virus adeno-associati Infettano le cellule in divisione o meno, ampio tropismo cellulare, potenziale d'integrazione, bassa immunogenicità e non patogenicità Limitate capacità per i transgeni, difficile generazione di alti titoli virali, presenza di adenovirus o herpevirus per la moltiplicazione dei virus adeno-associati Herpesvirus Infettano un'ampia varietà di tipi cellulari, alta capacità d'inserzione, tropismo naturale per le cellule neuronali, seguita dalla produzione di alti titoli virali Possibile tossicità, rischio di ricombinazione, nessuna integrazione virale nel DNA dell'ospite Poxvirus Alta capacità d'inserzione, possibile inserzione di grandi frammenti di DNA, alti livelli di espressione transgenica, seguita da virus vivo ricombinante Possibile effetto citopatico (cambiamenti cellulari morfologici e fisiologici) Virus di Epstein-Barr Infetta cellule in divisione o meno con prevalenza per i linfociti B, alta capacità d'inserimento Difficoltà di controllare le linee cellulari

Retrovirus Vettore retrovirale Lunghezza massima: 8Kb Trascrittasi inversa e integrasi Maturazione del genoma a RNA Proteina per involucro Psi + non codificante: per impacchettamento nel capside Lunga sequenza terminale ripetuta Vettore retrovirale Sostituzione di gag, pol, env con gene X: lunghezza max = 8 kb Marcatore selez: gene Neo Lunghezza massima: 8Kb

PREPARAZIONE RETROVIRUS PER L’INFEZIONE CELLULARE Linee cellulari per packaging: forniscono le necessarie funzioni di gag, pol, env, ma delete per gene psi; hanno inserito stabilmente i geni virali codificanti per proteine strutturali del capside, produce virioni vuoti per l’assemblaggio dei virioni. La loro transfezione transiente con vettore ricombinante determina l’impacchettamento del costrutto nel virione (contiene l’enzima transcrittasi inversa) vettore virale completo da usare per l’infezione delle cellule da trattare da Dr. Sara Caldarola

INFEZIONE CON RETROVIRUS DELLA CELLULA BERSAGLIO IL RETROVIRUS NON E’ IN GRADO DA SOLO DI REPLICARSI E PRODURRE PARTICELLE FAGICHE PER ALTRE INFEZIONI CELLULARI Dr. Sara Caldarola

Adenovirus Patogeno naturale dell’uomo, genoma a DNA a doppio filamento, causa il comune raffreddore Come vettore ha una delezione della regione E1 il che lo rende difettivo per la replicazione. Come cellule d'impaccamento vengono usate cellule renali embrionali.

Virus Adenoassociati Appartengono alla famiglia dei parvovirus. Genoma formato da una molecola di DNA a singolo filamento di circa 5 kb. Capside icosaedrico e sono privi d'un involucro lipidico. Non sembrano associati a nessuna patologia: ideali come vettori. Espressione prolungata del transgene Ma dimensioni ridotte del transgene (max 4,7 kb)

Terapia genica nei tumori Se inattivato gene soppressore tumore (oncosoppressore) introduzione nuova versione gene; Se attivato oncogène spegnimento con gene con RNA antisenso

Strategie di terapia genica somatica in malattie da aploinsufficienza Inserimento gene wt Inserimento mirato e doppia ricombina- zione per ripristino gene wt

Strategie di terapia genica somatica in malattie da acquisizione di funzione Produzione di RNA interferenti introdotti con vettori virali

Produzione di RNA interferenti introdotti con vettori virali

Si introduce nella cellula l’RNA del gene che si vuole silenziare a doppio filamento (dsRNA) Complesso Dicer: RNAsi che degrada lunghi filamenti di dsRNA a frammenti di circa 20 bp RISC: RNA-Induced Silencing Complex. (Formato da RNA e proteine) srotola ds RNA e il filamento complementare si appaia con RNA da silenziare, degradazione dell’ RNA a doppio filamento

Terapia genica dei tumori Es: ganciclovir Ganciclovir (Gcv): analogo di un nucleoside virale (metilguanina): uccide le cellule tk+, ovvero quelle con il vettore virale inserito Gcv Gcv-P Gcv-PPP Incorporazione DNA Terminazione catena rottura DNA Tk HSV Tk mamm

Terapia genica in vivo per i tumori cerebrali VPC = Cellule infettate da Herpes simplex (con gene Tk) che producono virioni impiantate nel tumore Produzione di timidina chinasi virale Somministrazione farmaco (GCV) Neuronavigazione stereoatassica guidata da MRI Gcv Gcv-P Gcv-PPP Incorporazione DNA Terminazione catena rottura DNA Tk HSV Tk mamm Ganciclovir (Gcv): analogo del nucleoside erpetico: uccide le cellule tk+, ovvero con il vettore virale inserito

TERAPIA GENICA NELLE MALATTIE UMANE MENDELIANE Malattia Gene introdotto Tessuto target ß-talassemia ß-globina Midollo osseo Immunodef. congenita (SCID) ADA Midollo/linfociti Distrofia muscolare Distrofina Muscolo Fibrosi cistica CFTR Epitelio alveoli Emofilia A e B Fattore VIII e IX Epatociti/muscoli Fenilchetonuria Fenilalanina idrossilasi Fegato Morbo di Gaucher Glucocerebrosidasi Midollo osseo Mucopolisaccaridosi tipo I -L-iduronidasi Fibroblasti Mucopolisaccaridosi tipo VII ß-glucuronidasi Midollo osseo Epidermolisi bullosa Laminina Cheratinociti

SCID: SEVERE COMBINED IMMUNODEFICIENCY DISEASE Assenza di Adenosina deaminasi (ADA) (enzima della via di recupero delle purine) Malattia AR: mancanza di cellule progenitrici dei linfociti T e accumulo metaboliti tossici (adenosina e derivati)

SCID: UN ESEMPIO DI SUCCESSO DELLA TERAPIA GENICA SOMATICA Terapia classica: Trapianto di midollo: compatibilità del 90-100% dell’HLA (una minoranza dei pazienti) Somministrazione di enzima ADA estratto dai bovini (correzione del metabolismo, ripristina in parte funzioni immunitarie). Terapia genica ex vivo: - Cellule staminali emopoietiche - Precursori linfociti T - Infezione con vettore retrovirale. Il cDNA dell’ADA dimensioni ridotte(1.5 Kb). Non è necessaria una regolazione fine dell’espressione genica con ripristino della fisiologia sia con alta che bassa efficienza di integrazione - Cellule con copia gene ADA hanno un vantaggio selettivo di crescita eliminando più facilmente i metaboliti tossici

Terapia con incremento delle copie geniche ex vivo con retrovirus per la deficienza di adenosina deaminasi (ADA) ADA Precursori linfociti T da midollo osseo paziente ADA- Terapia 6-7 volte l’anno. Dopo 5 anni recupero parziale della funzione immunitaria

Terapia genica per la deficienza di adenosina deaminasi (ADA) Linfociti T oppure Cellule staminali midollo osseo (tutte le linee emopoietiche transgeniche)

Malattia letale entro i 30 anni senza trattamenti. Terapia classica: Drenaggio bronchiale Somministrazione antibiotici Terapia genica ex vivo Vettori adenovirali per introdurre il gene CFRT nelle cellule dei polmoni tramite aereosol Problematiche: Tessuto polmonare crea barriere fisiche (muco) e immunitarie; difficile ingresso dell’adenovirus nel nucleo; reazioni infiammatorie; espressione a breve termine Terapia con staminali? Inserimento CFTR in vettori virali e infezione di staminali paziente (da midollo), spinte a differenziarsi ad epiteliali per ripopolare il polmone

COSA È LA DMD LA DISTROFIA MUSCOLARE DI DUCHENNE (DMD) E’ UNA GRAVE PATOLOGIE GENETICA, CAUSATA DALLA TOTALE ASSENZA DELLA DISTROFINA NEL MUSCOLO STRIATO E LISCIO. colpisce tutti i muscoli scheletrici, la muscolatura liscia e il cuore. difficoltà di deambulazione e di movimento insufficienza respiratoria problemi cardiaci DMD: conduce alla completa immobilità, l’aspettativa di vita non supera i 25-30 anni. A 10-12 anni i ragazzi vivono sulla carrozzina. La DMD è una malattia rara, con una ha una frequenza di 1 su 3500 Mutazioni dello stesso gene causano anche: La distrofia di Becker (DMB), meno invalidante con assenza parziale di distrofina. Cardiomiopatia dilatativa legata all’X 35

TUTTA COLPA DI UN GENE Il gene è localizzato sul braccio corto del cromosoma X. Le donne con una sola copia mutata del gene sono portatrici sane, gli uomini, essendo emizigoti, si ammalano. E’ il più lungo gene fin ora identificato, circa 2,3 Mb (79 esoni) mRNA rappresenta solo lo 0,5% del gene (circa 12 kb) 7 promotori, originano 1 proteina lunga e 6 versioni più corte. La distrofina, formata da 3685 aminoacidi, PM 427 kDa. 36

LA DISTROFINA Ancorata sulla faccia interna della membrana delle fibre muscolari. C- terminale è legato ad altre proteine di membrana. N-terminale è connesso alle strutture contrattili all’interno della cellula muscolare. Determinante per la stabilità meccanica della membrana durante la contrazione muscolare, funziona da ammortizzatore. Assenza o malfunzionamento causa rottura della membrana muscolare: Ingresso del calcio nelle fibre. Attivazione di enzimi. Infiammazione e attivazione dei fibroblasti. Formazione di tessuto cicatriziale che sostituisce quello muscolare. Degenerazione muscolare e insorgenza della patologia. 37

Terapia genica per la DMD Terapia di tipo sistemico (muscolatura striata, cuore, diaframma) Muscoli target difficilmente raggiungibili Transgene di dimensioni elevate (cDNA di 14 kb) Pochi vettori utilizzabili

TERAPIA GENETICA: L’EXON SKIPPING La mutazione elimina EX50 portando alla fusione di IVS 49 e IVS50; cambia il reading frame del gene della distrofina e cessa la produzione della proteina funzionale Viene indotto l’exon skipping (E.S.) dell’esone 51 nel pre-mRNA: Antisense Oligo (AO) che si attaccano alla sequenza dell’ESE (exonic-splicing-enhancer) all’interno dell’esone 51 E.S. ristabilisce il corretto schema di lettura (reading frame) modificando l’mRNA (EX49 in frame con EX52) La proteina è più corta ma ancora funzionante Converte la DMD in DMB in modo da ridurre la gravità della malattia

COME FUNZIONA L’EXON SKIPPING 1/2 AOS o Oligonucleotidi antisenso, corti frammenti di RNA, si appaiano in regioni coinvolte nello splicing del pre –mRNA, producendo splicing alternativo con rimozione di uno o piu esoni i 2 tipi di AOS più utilizzati nella sperimentazione per l’eliminazione dell’esone 51 sono: 2’O- metyl- fosforotioates, PRO05, formato da 20 basi Morfolino, AVI-4658, ha 30 basi, e include le 20 del PRO05 2’O-Metil AO morfolino AO UCUUUACGGUGAAGGAACU GAUCUUUACGGUGAAGGAACUACAACCYC

Il trattamento con una molecola antisenso, somministrata con iniezione intramuscolare. Lo studio, compiuto presso UCL (Londra) ha riguardato 7 ragazzi di età compresa tra 10 e 17 anni con DMD a cui era stata diagnosticata la malattia e in cui poteva risultare di beneficio lo skipping (salto) dell’esone 51. Due dei pazienti hanno ricevuto 0.09 mg dell’oligonucleotide antisenso AVI-4658, iniettato localmente in un piccolo muscolo del piede (extensor digitorum brevis). Gli altri 5 pazienti hanno ricevuto 0.9 mg di AVI-4658 nell’altro piede. I pazienti che hanno ricevuto il più basso dosaggio (0.09 mg) di AVI-4658 hanno mostrato poca espressione di distrofina, il dosaggio più alto (0.9 mg) ha prodotto un aumento dell’espressione di distrofina nel muscoli trattati. Nelle aree delle sezioni immunocolorate adiacenti al luogo in cui AVI-4658 è stato iniettato, il 44-79% delle miofibre ha aumentato l’espressione della distrofina. Fonte: Lancet Neurology, 2009

Caratteristiche del vettore ideale per la TERAPIA GENICA • Efficienza (trasduzione di un numero di cellule elevato). • Garanzia di una prolungata produzione della proteina terapeutica (a livelli adeguati). • Capacità di incorporare DNA di varie dimensioni. • Garanzia nella regolazione (trascrizionale, traduzionale o post-traduzionale) dell’espressione del gene introdotto • Non patogenicità • Facilità di somministrazione al paziente. • Capacità di raggiungere specificamente le cellule bersaglio. • Buona tolleranza. • Assenza di immunogenicità • Facilità di costruzione e riproducibilità IL VETTORE IDEALE NON ESISTE. I VETTORI PIU’ UTILIZZATI OGGI SONO I RETROVIRUS