Editing dellRNA
Editing dellmRNA per la Apolipoproteina B umana
Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006
Editing dellmRNA per la subunità B di GluR
Editing inserzionale in Tripanosoma
Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006 Editing di coxIII (mitocondri di tripanosoma)
Editing inserzionale mediante RNA guida
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Clonaggio PCR Amplificazione DNA
Vettori di clonaggio Plasmidi Virus Trasposoni Minicromosomi artificiali
Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006
sito di restrizione
Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006
Gli enzimi di restrizione possono generare diversi tipi di estremità
Uso degli enzimi di restrizione Clonaggio Mappa di restrizione Polimorfismi di restrizione (RFLP)
Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Scelta e preparazione del vettore Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Analisi dei prodotti
Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006
1.Origine di replicazione 2.Marcatore di selezione 3.Sito di restrizione unico Elementi di un vettore plasmidico
Vettori plasmidici
Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Scelta e preparazione del vettore Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Analisi dei prodotti
Preparazione del DNA da clonare Frammento di DNA genomico che può contenere regioni trascritte o non trascritte cDNA: DNA ottenuto per trascrizione inversa dellmRNA, che quindi contiene tutto o parte di una regione trascritta frammentato con enzimi di restriz. frammentazione meccanica DNA specifico Collezione DNA (banca, genoteca) Digestione clone già esistente PCR
Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006 Collezioni di DNA clonato (banca cDNA, genoteca)
Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006 PREPARAZIONE del cDNA RNA DNA
Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Scelta e preparazione del vettore Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Analisi dei prodotti
Unione, mediante ligasi, di estremità coesive create da un enzima di restrizione GAATTC CTTAAG G CTTAA AATTC G EcoRI GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG DNA ligasi GAATTC CTTAAG VETTORE G CTTAA AATTC G INSERTO
strategie controlli Reazione di ligasi
Inserzione di un frammento di DNA in un vettore circolare mediante ligasi di estremità coesive GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG G CTTAA AATTC G EcoRI GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG DNA ligasi AATTC G CTTAA EcoRI VETTORE INSERTO
trattamento del vettore con fosfatasi pAATTC G CTTAAp G AATTC CTTAApG GpAATTC CTTAA G DNA ligasi pAATTC G CTTAAp EcoRI G CTTAA AATTC G fosfatasi GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG Clonaggio con singola digestione
Clonaggio con doppia digestione GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG AAGCTT TTCGAA G CTTAA AGCTT A EcoRI AAGCTT TTCGAA GAATTC CTTAAG DNA ligasi AATTC G A TTCGA EcoRI HindIII AAGCTT TTCGAA HindIII
Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Scelta e preparazione del vettore Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Analisi dei prodotti
Introduzione del DNA nella cellula ospite Trasformazione: CaCl2 Impacchettamento e infezione fagica In E.coli Elettroporazione In cellule di eucarioti superiori Trasfezione (transiente o stabile): Calcio fosfato Liposomi Elettroporazione Microiniezione DNA gun
Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Scelta e preparazione del vettore Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Analisi dei prodotti
Vettori plasmidici
Strategie di selezione nel clonaggio AMPICILLINA resistenza
Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Scelta e preparazione del vettore Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Analisi dei prodotti
1200 bp SacI EcoRI
1.lisi cellulare 2.deproteinizzazione 3.concentrazione Isolamento acidi nucleici
Spettrofotometro (quantitativa) Elettroforesi su gel (qualitativa, semiquantitativa) Analisi acidi nucleici
Spettro di assorbimento del DNA lunghezza donda (nm) Assorbanza (OD) 1 OD 260 =50 g/ml OD 260 /OD 280 =1,8-2,0
Elettroforesi di acidi nucleici Gel di agarosio Gel di acrilammide
Elettroforesi su gel di agarosio
Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006
Migrazione del DNA su gel Le molecole lineari di dsDNA migrano a velocità inversamente proporzionali al logaritmo in base 10 del numero di paia di basi.
Fattori che influenzano la migrazione Peso molecolare Concentrazione di agarosio Conformazione DNA Voltaggio applicato Intercalanti Tampone di elettroforesi
Visualizzazione del DNA
Marcatori di peso molecolare HindIII
Tecniche di trasferimento su membrana (Blotting) Southern (blot) Northern (blot) Western (blot)
BLOTTING (TRASFERIMENTO) Molecole trasferite SondaGel SouthernDNA DNA o RNA Agarosio o acrilammide NorthernRNA DNA o RNA Agarosio o acrilammide WesternProteineAnticorpi Acrilammide
Metodi di trasferimento Capillare Elettroblot
carta 3MM membrana nylon gel supporto } carta 3MM tampone vaschetta Assemblaggio del blot capillare
Fattori che influenzano libridazione Temperatura Forza ionica pH
Esempio di Southern blot genomico
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