CHIMICA DEGLI ALIMENTI CON ESERCITAZIONI DI LABORATORIO CdL Scienza della Nutrizione (III anno) Dr.ssa Alessia Fazio Dr. Pierluigi Plastina 1

Orario delle lezioni teoriche: Martedì 14.30-16.30 aula circolare Giovedì 14.30-16.30 aula 21 (fino a fine Ottobre e in caso di ulteriori necessità) Orario delle esercitazioni di laboratorio: Lunedì 14.30-16.30 lab. Sottovia (a partire da fine Ottobre, divisi in gruppi) Frequenza obbligatoria ! 2

MODALITA’ D’ESAME Prova orale per verificare la conoscenza delle tecniche studiate e la competenza sulle esercitazioni condotte

Definizione di alimento Qualsiasi sostanza che viene introdotta nell’organismo umano per produrre, attraverso un processo metabolico, energia, calore e materiale di reintegro e di accrescimento, assicurando il normale svolgimento delle funzioni vitali.

Scopo dell’analisi sugli alimenti: Aspetti nutrizionali Determinazione della composizione chimica Qualità degli alimenti Vitamine, principi nutritivi Aspetti legali Controllo dei limiti di legge Sostanze tossiche (es. aflatossine, mercurio) Pratiche illecite (zucchero nel vino)

Considerazioni sulle tecniche La chimica analitica degli alimenti è una disciplina piuttosto complessa in quanto il numero di sostanze d’interesse (o analiti) è elevato.

Principali classi di composti presenti negli alimenti Principi nutritivi che apportano energia: lipidi glucidi protidi

Principi nutritivi che non apportano energia: acqua sali minerali vitamine

Sostanze presenti negli alimenti diverse dai principi nutritivi: sostanze derivanti dalle trasformazioni dei principi nutritivi sostanze responsabili dei caratteri organolettici degli alimenti additivi alimentari contaminanti

Considerazioni sulle tecniche Inoltre, le matrici considerate vanno dall’acqua potabile alle carni al miele, imponendo metodi di trattamento molto diversi da una matrice all’altra

Considerazioni sulle tecniche E’ praticamente impossibile adottare procedure analitiche comuni per la caratterizzazione di tutti i tipi di alimenti. Ogni alimento e ogni classe di analiti richiedono una procedura specifica.

Tecniche analitiche utilizzate Tecniche di spettroscopia atomica (GF-AAS, FAAS, ICP-AES, ICP-MS) per la determinazione elementare Tecniche cromatografiche (HPLC, IC, GC) per la separazione e determinazione di miscele di composti organici ed inorganici Tecniche spettrofotometriche (UV-visibile, IR) per la determinazione di parametri analitici o di specie che assorbono nell’intervallo UV-IR Tecniche volumetriche (titolazione acido-base, redox) per la determinazione di parametri vari

Schema dell’analisi sugli alimenti ANALITI DI INTERESSE ALIMENTO SCELTA DELLA TECNICA CAMPIONAMENTO PRETRATTAMENTO ANALISI CHIMICA-STRUMENTALE ANALISI DEI DATI CONTROLLO DI QUALITA’

Aspetti nutrizionali Dal punto di vista nutrizionale, l’analisi degli alimenti ci dà un’idea dei potenziali benefici apportati dall’assunzione degli alimenti. Per questo motivo sull’etichetta di molti prodotti sono riportate le determinazioni di parametri quali: vitamine sali minerali (sottolineando a volte la carenza, a volte l’abbondanza) macromolecole (proteine, grassi, carboidrati, ecc.) principi nutritivi non meglio identificati (Omega 3)

Parametri analitici studiati Il numero di sostanze di interesse nel campo agroalimentare è ovviamente elevatissimo. Soltanto in relazione agli aspetti sanitari, possiamo stimare in diverse decine di migliaia le specie chimiche classificate come indesiderate, comprendenti le seguenti classi:

Metalli pesanti (As, Cd, Hg, Pb) Specie metalliche composti organometallici (metilmercurio, tetraetilpiombo, ecc.) ioni metallici a diverso stato di ossidazione, es. Cr(III) e Cr(VI) Composti inorganici sali minerali (nitriti, nitrati, fosfati, ecc.) Composti organici derivanti da reazioni chimiche (PAH, PCB, BTEX, diossine) derivanti da attività biologica (aflatossine) residui di composti impiegati nella produzione (pesticidi, fungicidi)

Importanza dell’analisi degli alimenti-1 Dal punto di vista sanitario, l’analisi degli alimenti è l’unica garanzia per la nostra salute relativamente a ciò che mangiamo. Le frodi alimentari sono infatti alquanto diffuse e non sempre è possibile portarle alla luce. La frode può intervenire su vari livelli:

Importanza dell’analisi degli alimenti-2 Un alimento è prodotto e commercializzato con materie prime di scarsa qualità Materie prime conservate non correttamente Materie prime contaminate (es. Hg in pesce, Mucca pazza) Trattamenti che causano contaminazioni Un alimento è commercializzato utilizzando un marchio o una denominazione non corrispondente Parmesan tedesco Vino non corrispondente alla denominazione

Importanza dell’analisi degli alimenti-3 Un alimento è commercializzato sostituendo completamente o parzialmente il prodotto autentico con un’alternativa simile ma meno costosa succo d’arancio adulterato con succo di mela olio d’oliva miscelato con altri oli vegetali Un alimento è prodotto con procedimenti non conformi olio d’oliva extravergine prodotto per estrazione con solventi Un alimento è prodotto con pratiche non consentite zucchero nel vino o nei succhi di frutta

Legislazione vigente La legislazione vigente differisce a paese a paese. Si considerino, per esempio, le differenze relative ai limiti di metalli tossici nel vino

Il pretrattamento L’insieme delle procedure richieste per avere l’analita o gli analiti di interesse in forma determinabile. Stadio preliminare che consiste nel portare la matrice nella forma più opportuna ai fini della determinazione analitica.

Il pretrattamento A seconda della natura chimica dell’alimento (organica o inorganica; acida, basica o neutra; solubile in solvente acquoso o in solventi organici), degli analiti di interesse e della tecnica analitica che si andrà ad utilizzare, deve essere selezionato il metodo di pretrattamento più opportuno

Il pretrattamento La maggioranza delle analisi si effettuano per via umida. Il campione, se non è già liquido, va portato in soluzione o quantomeno va solubilizzata la parte che contiene l’analita o gli analiti di interesse. Generalmente, quindi, il pretrattamento coincide o termina con uno stadio di solubilizzazione.

Tipi di pretrattamento Digestione umida con reattivi di solubilizzazione e/o ossidazione In sistemi chiusi Con microonde Separazione con membrane Filtri Ultrafiltrazione Dialisi Estrazione Con solvente Con solvente accelerata (ASE) Con un fluido supercritico (SFE) Con fase solida (SPE) Incenerimento Derivatizzazione

Tipi di pretrattamento 1. Digestione umida Tecnica molto utilizzata per la determinazione di specie inorganiche (metalli, anioni). Non è adatta per la determinazione di specie organiche termolabili. Il processo di digestione avviene all’interno di un contenitore nel quale sono introdotti il campione finemente suddiviso e i reattivi di solubilizzazione, eventualmente coadiuvati da reattivi di ossidazione.

Reattivi di solubilizzazione HNO3, esercita azione ossidante a caldo ed è in grado di rompere i legami glicosidici H2SO4, esercita azione ossidante e disidratante HClO4, esercita azione ossidante Acqua regia (acido nitrico + cloridrico 1:3), esercita azione ossidante molto forte H2O2, esercita azione ossidante

Precauzioni nella digestione Le quantità di reagenti e di campione introdotte devono essere compatibili con il volume del sistema. Considerando che la maggior parte delle matrici alimentari contiene sostanze organiche, va considerata la liberazione di composti gassosi conseguenti alla digestione, che può provocare sovrapressioni: (C, H, O) + acido ossidante  H2O + CO2 Il volume dei gas liberati è ovviamente molto maggiore rispetto alla miscela campione-reagenti di partenza Il contenuto di carbonio nei cibi è quindi un valore da tener presente nel progettare un pretrattamento per digestione umida

Applicazioni della digestione La digestione umida è particolarmente efficace per il pretrattamento di alimenti a base di carboidrati (zuccheri, amidi, cellulosa, ecc.) che sono facilmente mineralizzati con acido nitrico a 180°C. Più complessa è la solubilizzazione di matrici contenenti grassi e proteine, che può richiedere l’addizione di acido perclorico per avere una dissoluzione completa.

Digestione umida con microonde Una variante più efficace della semplice digestione umida. L’energia associata alle microonde (600-1500 W) non è in grado di rompere direttamente i legami molecolari, ma può essere assorbita da sostanze come l’acqua e gli acidi minerali, che in questo modo si scaldano rapidamente e sono in grado di solubilizzare il campione in maniera più efficiente e in tempi minori

2. Estrazione con solvente Tipi di pretrattamento 2. Estrazione con solvente Tecnica di pretrattamento molto comune, utilizzata in tutti i casi in cui non è necessaria o è anzi controindicata la solubilizzazione totale del campione. Permette di solubilizzare selettivamente gli analiti di interesse, lasciando la matrice quasi intatta.

Estrazione con solvente Permette di portare in soluzione selettivamente i composti di interesse, lasciando la matrice quasi intatta. Estrazione

Estrazione con solvente-2 Si effettua in contenitore chiuso ponendo il campione a contatto con un solvente con esso immiscibile, nel quale siano però solubili gli analiti. Estrazione liquido/liquido se sono liquidi sia il campione sia il solvente estraente Estrazione liquido/solido se si effettua con un solvente liquido su un campione solido

Esecuzione dell’estrazione

Estrazione con Soxhlet L’estrattore Soxhlet consente di effettuare lunghi cicli di estrazione in modalità semiautomatica con buon recuperi. Il campione è posto all’interno di un ditale poroso permeabile al solvente estraente.

Batteria di estrattori Soxhlet La procedura è automatizzabile in batteria (Soxhtec) per poter agire su più campioni contemporaneamente

Modalità di estrazione Imbuto Separatore: pochi campioni piccole quantità di campione oppure… elevate quantità di solvente Estrattore di Soxhlet: numerosi campioni grosse quantità batteria di estrattori (Soxhtec)

3. Incenerimento (Ashing) Tipi di pretrattamento 3. Incenerimento (Ashing) Trattare un campione solido a temperature elevate (450°C ≤ T ≤ 600°C) senza fiamma, in modo da causare la parziale o totale decomposizione delle sostanze organiche presenti e di parte di quelle inorganiche.

Residuo dell’incenerimento Il residuo di questo trattamento termico può essere composto da ossidi e da sali (fosfati, cloruri, solfati, silicati di metalli alcalini e alcalino-terrosi), di colore biancastro. Una colorazione nera o bruna è indice di un incenerimento parziale Determinazione di parametri inorganici, come il contenuto di metalli, anioni o il residuo secco

Principio del metodo Pesare una quantità nota di campione e porla in un crogiolo o in un contenitore apposito (termoresistente, es. vetro Pyrex). Il contenitore è poi inserito all’interno di un forno o muffola che viene sottoposto ad un ciclo di temperatura crescente.

Dopo l’incenerimento Si lascia raffreddare e si preleva il contenitore. Se si è interessati soltanto al residuo secco è sufficiente pesare il crogiolo prima e dopo l’incenerimento. Se si è interessati a determinare alcuni analiti è necessario portare in soluzione il residuo

Vantaggi non richiede l’uso di reagenti molto economico scarso pericolo di contaminazione molto semplice da eseguire elevato numero di campioni trattabili simultaneamente (dipende dalle dimensioni del forno)

Svantaggi richiede muffola a temperatura controllata processo lungo (12-18 ore) richiede una certa attenzione per le reazioni che può provocare perdite di campione  perdita di analita combustione  danno al forno emissione di vapori non adatto per determinazione di composti volatili non adatto per la maggior parte dei composti organici

Tipi di pretrattamento 4. Derivatizzazione Reazione chimica di trasformazione di un composto in un suo derivato, mediante modificazione di un gruppo funzionale

Problema: Determinazione degli acidi grassi nell’olio La determinazione degli acidi grassi è eseguita mediante gascromatografia (GC). L’olio non si inietta direttamente nel GC ! PRETRATTAMENTO I triacilgliceroli (caratterizzati da residui di acidi grassi) vengono trasformati, mediante transesterificazione, nei rispettivi esteri metilici, che presentano una maggiore volatilità ed una minore polarità rispetto ai corrispondenti acidi liberi; i gliceridi hanno invece scarsa volatilità.

Catalizzatori: idrossido di sodio o di potassio La transesterificazione ha come risultato la rottura dei legami esteri della molecola di trigliceride con formazione di 3 esteri metilici Catalizzatori: idrossido di sodio o di potassio

Determinazione degli acidi grassi Gli esteri metilici degli acidi grassi (Fatty Acid Methyl Esters, FAMEs) vengono analizzati come tali. Questa determinazione fornisce quindi la composizione in esteri metilici anzichè in acidi grassi; in pratica, la differenza tra le due composizioni è abbastanza piccola e comunque tutti i valori tabulati di riferimento sono basati sui metilati, quindi non si ha alcuna incertezza di attribuzione

FAMEs nell’olio di oliva La

FAMEs nell’olio di arachidi

FAMEs nell’olio di colza

-sitosterolo colesterolo Steroli nell’olio La determinazione della frazione sterolica totale e dei singoli steroli è indispensabile nell’analisi dell’olio d’oliva. I motivi sono da ricercarsi nel fatto che la frazione sterolica non è influenzabile da variazioni genetiche, che invece possono mutare radicalmente la componente saponificabile e quella degli acidi grassi. La sofisticazione dell’olio è quindi rilevabile facilmente in base al tipo di steroli identificati Tra gli steroli dell’olio, il -sitosterolo (sx) costituisce circa l'80% del totale; il colesterolo (dx), invece si trova solo nei grassi animali -sitosterolo colesterolo

Determinazione degli steroli Siccome gli steroli non sono sufficientemente volatili per essere separati con la GC, dopo il recupero dalla lastrina TLC è necessaria la loro derivatizzazione in eteri trimetilsililici; la reazione avviene con trimetilsilil cloruro (CH3)3Si-Cl in piridina (Py): RO-Si(CH3)3 + HCl R-OH + (CH3)3Si-Cl Py