L. 499/99 - PROGRAMMI INTERREGIONALI PROGRAMMA "SVILUPPO RURALE" SOTTOPROGRAMMA "INNOVAZIONE E RICERCA" D.M. n. 25279 del 23/12/03 DIAGNOSI DI AGENTI PATOGENI TRASMESSI MEDIANTE IL MATERIALE DI PROPAGAZIONE Dr.ssa Loconsole Giuliana (DPPMA) - Università degli Studi di Bari Tematica 2 : “Diagnosi fitopatologica e risanamento” Attività 2.1 “Accertamenti virologici” Attività 2.3 “Diagnosi di patogeni fungini in vivaio” Responsabile Dott. ssa Saponari Maria (CRSA) Qualificazione del Vivaismo Olivicolo: Caratterizzazione Varietale, Sanitaria e Innovazioni Nella Tecnica Vivaistica (OLVIVA)

Utilizzo di materiale di propagazione certificato materiale vegetale d’olivo deve soddisfare i requisiti sanitari e genetici imposti dalle direttive CEE sulle condizioni minime per la commercializzazione dei materiali di moltiplicazione. (Conformitas Agraria Communitatis -CAC, Dir. n. 92/34 del 28 aprile 1992, e Dir. n. 93/48 del 23 giugno 1993 recepite con decreto ministeriale 14/04/1997) In Italia sistema di certificazione volontaria che assicura garanzie di tipo fitosanitario e di corrispondenza varietale e la tracciabilità di tutta la produzione nazionale. DM 16/06/1993 (Virus esente e/o virus controllato)

Produzione e utilizzo di materiale di propagazione certificato Aspetto fondamentale Disponibilità di strumenti diagnostici in grado di identificare gli agenti patogeni in maniera inequivocabile nei materiali di propagazione in ogni fase della filiera vivaistica

ATTIVITA’ 2.1 “Accertamenti virologici” Stato dell’arte fino ad oggi identificati 14 agenti virali dell’olivo Specie Genere 1. Strawberry latent ringspot virus 2. Arabis mosaic virus 3. Cherry leafroll virus 4. Tobacco mosaic virus 5. Cucumber mosaic virus 6. Tobacco necrosis virus 7. Olive latent virus 1 8. Olive latent ringspot virus 9. Olive latent virus 2 10. Olive vein yellowing associated virus 11. Olive yellow mottling and decline-associated virus 12. Olive semilatent virus 13. Olive leaf yellowing-associated virus 14. Olive mild mosaic virus (SLRV) (ArMV) (CLRV) (TMV) (CMV) (TNV) (OLV-1) (OLRSV) (OLV-2) (OVYaV) (OMYDaV) (OSLV) (OLYaV) (OMMV) Nepovirus “ Tobamovirus Cucumovirus Necrovirus Oleavirus Potexvirus Undetermined Closterovirus

virus contemplati dalle normative fitosanitarie ATTIVITA’ 2.1 “Accertamenti virologici” – Stato dell’arte virus contemplati dalle normative fitosanitarie Materiale CAC Esenza da tutti virus DM 14/4/97 - D.M. 4/05/2006 - Disciplinare di produzione del materiale di propagazione di olivo ArMV CLRV SLRV CMV OLV-1 OLV-2 OLYaV TNV ArMV CLRV SLRV OLV-1 OLYaV VF VT

Attualmente metodologie diagnostiche molecolari ATTIVITA’ 2.1 “Accertamenti virologici “– Stato dell’arte Attualmente metodologie diagnostiche molecolari IBRIDAZIONE MOLECOLARE CON RIBOSONDE VIRUS SPECIFICHE (Grieco et al., 2000; Saponari et al.,2001) 2) RT-PCR con primers virus-specifici (Grieco et al., 2000) 3) ONE-STEP RT-PCR con primers virus-specifici (Faggioli et al., 2005) determinazione della virus esenza 4) Analisi del dsRNA

ATTIVITA’ 2.1 “Accertamenti virologici” – Stato dell’arte A seguito dell’applicazione di tali tecniche di diagnosi, l’olivo si è rivelato negli ultimi anni ospite di molti agenti virali, che conseguentemente hanno reso indispensabile, anche per questa specie, numerosi programmi di accertamento sanitario mediante saggi di laboratorio

OBIETTIVO - DIAGNOSI FITOPATOLOGICA (Tem.2) ATTIVITA’ 2.1 “Accertamenti virologici” INDIVIDUAZIONE DI MATERIALE SANITARIAMENTE MIGLIORATO per la produzione di Fonti Primarie di Cloni e Varietà di interesse per le aree oggetto dell’intervento mediante VERIFICA DELLO STATO SANITARIO con TECNICHE DI DIAGNOSI INNOVATIVE E VALIDATE per l’identificazione univoca dei principali agenti virali contemplati dalle normative di certificazione

2.1 “Accertamenti virologici” Attività previste e metodologie impiegate Valutazione dello stato sanitario del materiale oggetto di caratterizzazione varietale, verifica assenza dei principali agenti virali contemplati dalle normative per la certificazione (I e II anno) 1. Scelta dei genotipi da sottoporre ad accertamenti fitosanitari 20 genotipi per ciascuna varietà oggetto delle attività di caratterizzazione varietale

2. Raccolta dei campioni e distribuzione nei laboratori 2.1 “Accertamenti virologici” – Attività previste e metodologie impiegate Rami, talee (campioni distribuiti a tutti i laboratori per ring-tests) 2. Raccolta dei campioni e distribuzione nei laboratori 3. Analisi di laboratorio Dot blot hybridization su TNA, estratti con microcromatografia su particelle di silica, mediante ribosonde marcate con digossigenina (Saponari et al., 2001) per diagnosi simultanea di ArMV SLRV CLRV OLV-1

RT-PCR con primers virus-specifici (Grieco et al., 2000) per OLYaV 2.1 “Accertamenti virologici” – Attività previste e metodologie impiegate ONE-STEP RT-PCR con primers virus-specifici (Faggioli et al., 2005) per ArMV, SLRV, CLRV, OLV-1, OLYaV RT-PCR con primers virus-specifici (Grieco et al., 2000) per OLYaV Estrazione ed analisi elettroforetica dei dsRNA (virus-esenza)

2.1 “Accertamenti virologici” – Attività previste e metodologie impiegate 4. Messa a punto di tecniche rapide ed affidabili, come valida alternativa al dsRNA lungo e laborioso, che richiedano quantità minime di campione. 5. Messa a punto di un protocollo di diagnosi multipla di tutti i virus riscontrabili in olivo risparmio tempi e costi. 6. Comparazione risultati e definizione protocollo comune (diagnosi multipla)

2.1 “Accertamenti virologici” – Attività previste e metodologie impiegate 7. Accertamenti sanitari mirati sul materiale (II e III anno) ambientato, termotrattato e rigenerato in vitro 8. Moltiplicazione per innesto o autoradicazione (III anno), in condizione controllate, del materiale che risulterà rispondente ai requisiti fitosanitari imposti dalle normative di certificazione

ATTIVITA’ 2.3 Diagnosi di patogeni fungini in vivaio Stato dell’arte D.M. 14/07/1997 Verticillium dahliae D.M. 16/06/1993 La verticilliosi è la malattia fungina più importante dell’olivo e risulta grave soprattutto negli impianti giovani.

La malattia mostra un aumento della diffusione in tutti i paesi del bacino del Mediterraneo, soprattutto negli impianti giovani ed intensivi, probabilmente a causa dell’impiego di materiale di propagazione infetto e dell’impianto in terreni contaminati dal patogeno (Jimenz-Diaz et al., 1998; Nigro et al., 2005).

ATTIVITA’ 2.3 “ Diagnosi patogeni fungini in vivaio” – Stato dell’arte Considerata l’inefficacia dei mezzi chimici tradizionali nella lotta contro la malattia, gli accertamenti fitosanitari sul materiale di propagazione e sui terreni oggetto dei nuovi impianti costituiscono un importante strumento di difesa.

Strategie nella lotta contro Vertillium dahliae ATTIVITA’ 2.3 “ Diagnosi patogeni fungini in vivaio” – Stato dell’arte Strategie nella lotta contro Vertillium dahliae impiego di materiale di propagazione sano monitoraggio dei propaguli nel terreno Tecniche di diagnosi tradizionali isolamento del patogeno da porzioni di legno su substrato agarizzato determinazione della densità di inoculo dei microsclerozi nel terreno mediante substrato semiselettivo

Tecniche di diagnosi molecolare ATTIVITA’ 2.3 “ Diagnosi patogeni fungini in vivaio” – Stato dell’arte Tecniche di diagnosi molecolare PCR DPPMA messa a punto di un protocollo di Real time Scorpion-PCR per V. dahliae (Nigro et al., 2001, 2002, 2004) Alternativa ai metodi tradizionali per identificare il patogeno sia nel terreno che nel legno di piante infette il trasferimento di tale tecnica ai laboratori accreditati necessita di una validazione su larga scala (affidabilità e validità)

Marciume radicale da Phytophtora spp. ATTIVITA’ 2.3 “ Diagnosi patogeni fungini in vivaio” – Stato dell’arte Marciume radicale da Phytophtora spp. nel mediterraneo ed in Italia meridionale osservati casi di disseccamenti e morte di giovani piante di olivo causati da diverse specie di Phytophthora (Magnano di San Lio et al. 1999; Sanchez Hernandez et al., 2001). indagini in Puglia, sia in vivaio sia in giovani impianti intensivi di olivo, hanno indicato la diffusa presenza di diverse specie di Phytophthora nel terreno alcune delle quali associate a gravi casi di marciume radicale. Alcune di queste sono state identificate come P. palmivora P. citricola e P. megasperma (Nigro e Ippolito, dati non pubblicati); tuttavia, P. palmivora è la specie più frequente.

Strategie nella lotta contro Phytophtora spp. ATTIVITA’ 2.3 “ Diagnosi patogeni fungini in vivaio” – Stato dell’arte Strategie nella lotta contro Phytophtora spp. impiego di materiale di propagazione sano capillare monitoraggio dei propaguli del patogeno nel terreno e sulle radichette in vivaio corretta identificazione delle specie coinvolte

Tecniche di diagnosi tradizionali ATTIVITA’ 2.3 “ Diagnosi patogeni fungini in vivaio” – Stato dell’arte Tecniche di diagnosi tradizionali Propaguli di Phytophthora spp. isolati da terreno su substrato selettivo.

Sequenziamento dell’intera regione IGS di P. palmivora ATTIVITA’ 2.3 “ Diagnosi patogeni fungini in vivaio” – Stato dell’arte Diagnosi molecolare individuazione di primer specifici utili per lo sviluppo di un protocollo diagnostico molecolare. Sequenziamento dell’intera regione IGS di P. palmivora

ATTIVITA’ 2.3 Diagnosi di patogeni fungini in vivaio Necessità per i laboratori accreditati di protocolli diagnostici semplici, rapidi ed affidabili per gli accertamenti fitosanitari per V. dahliae Phytophthora spp. produzione di piantine di olivo dotate di elevati standard Obiettivi 1) Validazione di un protocollo diagnostico molecolare (Real-time Scorpion-PCR) per V. dahliae 2) Monitoraggio delle specie di Phytophthora patogene di olivo presenti in vivai pugliesi (corretta identificazione, determinazione della patogenicità, numero di propaguli) 3) Sviluppo di un metodo molecolare (possibilmente Real-time PCR) per la diagnosi della/e specie di Phytophthora più frequenti in vivaio.

2.3 “Diagnosi di patogeni fungini in vivaio” Attività previste Verticillium dahliae 1. Raccolta di campioni di terreno, miscele e piantine di olivo in vivai 2. Saggi diagnostici con tecnica tradizionale e molecolare (Real-time Scorpion-PCR) su campioni di terreno e di piantine sia prelevati in vivaio che inoculati artificialmente con il patogeno 3. Comparazione statistica dei risultati ottenuti con le due metodiche: test di significatività sulla affidabilità della dimensione del campione e della metodica molecolare.

2. Saggi di patogenicità in ambiente controllato ATTIVITA’ 2.3 “ Diagnosi patogeni fungini in vivaio” – Attività previste Phytophtora spp. 1. Raccolta, identificazione e caratterizzazione morfologica (chiavi tassonomiche e ceppi di riferimento di collezioni internazionali) di Phytophtora spp. presenti sulle varietà di olivo più diffuse nei vivai 2. Saggi di patogenicità in ambiente controllato 3. Individuazione di primers nella regione IGS e prove di specificità su DNA estratto da coltura pura, da campioni di terreno e radichette inoculate artificialmente

ATTIVITA’ 2.3 “ Diagnosi patogeni fungini in vivaio” – Attività previste Phytophtora spp. 4. Saggi diagnostici con metodica tradizionale e molecolare su campioni di terreno e radichette di olivo prelevati da piantine di olivo in vivaio risultate infette nel corso del monitoraggio 5. Individuazione della dimensione del campione e comparazione statistica tra i risultati ottenuti con le due metodiche

RISULTATI ATTESI - CONCLUSIONI ATTIVITA’ 2.1, 2.3 “Diagnosi fitopatologica” RISULTATI ATTESI - CONCLUSIONI Dati sulla situazione fitosanitaria, con particolare riferimento ai problemi virologici, di ecotipi e di cultivar locali di olivo in tutte le regioni interessate al progetto Dati sui problemi fitosanitari che più frequentemente si riscontrano in vivaio e individuazione dei punti critici che compromettono la sanità delle piante in vivaio Nuovi protocolli diagnostici, rapidi e affidabili, in alternativa al dsRNA e per l’identificazione multipla dei virus dell’olivo

RISULTATI ATTESI - CONCLUSIONI ATTIVITA’ 2.1 e 2.3 “Diagnosi fitopatologica ” RISULTATI ATTESI - CONCLUSIONI Protocollo per la diagnosi molecolare di V. dahliae Dati sulla incidenza dell’infezione radicale e sulla densità di inoculo della/e specie di Phytophthora agenti di marciume radicale sulle piantine di olivo Protocollo per la diagnosi molecolare della/e specie più frequente di Phytophthora

RISULTATI ATTESI - CONCLUSIONI ATTIVITA’ 2.1 e 2.3 “Diagnosi fitopatologica” RISULTATI ATTESI - CONCLUSIONI Selezione/Produzione di ecotipi esenti dagli organismi patogeni contemplati dalle normative Protocolli comuni da utilizzare per i controlli fitosanitari sui materiali di propagazione in ogni fase della filiera di certificazione: selezione sanitaria; - risanamento; - conservazioni fonti primarie; - commercializzazione.

Risultati dei saggi mediante dsRNA su campioni di olivo provenienti da diversi Paesi N° CAMPIONI SAGGIATI POSITIVI INFEZIONI (%) ITALY 428 365 85 EGYPT 40 33 82 GREECE 78 49 62 LEBANON 30 21 70 MALTA 10 4 PALESTINE 11 7 64 CIPRO 6 2 SPAIN 24 42 TUNISIA 100 AUSTRALIA 3 50 MAROCCO 8 80 USA 137 51 37 TOTALE 790 563