Terapia genica Inibizione mirata dell’espressione genica per bloccare un processo patologico Distruzione mirata geneticamente di specifiche cellule Supplementazione: fornire una copia funzionante del gene difettoso Sostituzione: sostituire il gene mutante con una copia funzionante in situ

Supplementazione: fornire una copia funzionante del gene difettoso ex vivo: trasferire i geni clonati in cellule in coltura, selezionare le cellule, espanderle in vitro e poi immetterle nel paziente in vivo: trasferire direttamente i geni nel tessuto bersaglio o in circolo, facendo in modo che poi arrivi al tessuto bersaglio

ex vivo

Vettori non virali per la terapia genica Liposomi: vescicole sintetiche che si formano quando alcuni lipidi sono in soluzione acquosa. Possono essere anionici e circondano il DNA o cationici e legano il DNA all’esterno iniezione diretta di plasmidi o bombardamento del tessuto del DNA attaccato a pellets di metallo (biolistico). Il trasferimento è molto basso e il DNA non è integrato.

Liposomi

Virus per la terapia genica Retrovirus: sono ad RNA e sintetizzano cDNA che integrano casualmente nel genoma dell’ospite quando si dissolve la membrana nucleare (divisione cellulare) Adenovirus: sono a DNA e capaci di trasdurre ad alti titoli tutte le cellule, ma in forma episomale. E’ molto forte la reazione immunitaria. Morte di Jesse Gelsinger nel 1999 Adeno-associati (AAV) hanno DNA a singola elica e si potrebbero integrare sul cromosoma 19q13 grazie al gene rep. Ma il 96% del genoma è deleto. Possono ospitare fino a 4.5kb Lentivirus: sono retrovirus specializzati che infettano anche le cellule non in divisione. Sono più complessi dei retrovirus e sono capaci di un’espressione a lungo termine.

Vettori virali per la terapia genica   Genoma Stato Capacità Target AAV Dna Integrato Episomal 4.7 kb D/ND Adeno < 36 kb Retro Rna 8 kb D Lenti HSV >50kb

Virus Adeno-associato Famiglia: Parvoviride Genere : Dependovirus Genoma : DNAss 4.7kb Bersaglio: Cellule in divisione e cellule non in divisione Stato : episomale/integrazione sito specifica su 19q13.3 Sierotipi : 10 AAV1-10 AAV2 ITR ITR Rep Cap Rep78 Rep52 VP1 VP3 Rep68 Rep40 VP2

TRANSGENE TERAPEUTICO MAX 4.5kb AAV RICOMBINANTI REP TRANSGENE CAP ITR ITR p5 p19 p40 Plasmide Cis TRANSGENE TERAPEUTICO MAX 4.5kb ITR ITR

Produzione di vettori rAAV rep2 cap Trans ITR2 ITR2 Pro Transgene pA E2A E4 VAI Cis Adeno Helper Tripla trasfezione HEK 293 cells (E1) rAAV

rAAV Pseudotipizzati AAV2/1 (6) AAV2/2 AAV2/3 AAV2/4 AAV2/5 AAV2/7 Cap 1 ITR 2 Rep 2 gene terapeutico rAAV Pseudotipizzati AAV2/1 (6) AAV2/2 Rep 2 Cap 2 ITR 2 AAV2/5 Cap 5 AAV2/3 Cap 3 AAV2/7 Cap 7 AAV2/4 Cap 4 AAV2/8 Cap 8

DIFFERENZE TRA SIEROTIPI AAV 1-8 PROTEINE CAPSIDE ANTIGENICITA’ TROPISMO AAV1 Muscolo,retina AAV2 Muscolo,fegato AAV4 Cervello AAV5 Cervello,polm. AAV6 Muscolo,retina AAV7 Muscolo,fegato AAV8 Fegato RECETTORI AAV2 FGFR1,EPARINA AAV4 Ac.SIALICO AAV5 PDGFR, Ac.SIALICO

Vantaggi Svantaggi Non patogeni Espressione genica efficiente e a lungo termine Pochi effetti immunologici Ampia varietà di cellule ospiti Infezione di cellule in divisione e non in divisione Svantaggi Dimensioni dell’inserto non superiori alle 4.5kb Produzione di anticorpi anti-AAV AAV2 No risomministrazione del vettore virale

Analisi di linkage Vincenzo Nigro Dipartimento di Patologia Generale Seconda Università degli Studi di Napoli Telethon Institute of Genetics and Medicine (TIGEM)

trasmissione autosomica dominante un genitore entrambi i genitori Aa aa Aa Aa A allele patologico dominante a allele normale recessivo Aa Aa aa aa AA Aa Aa aa 50% dei figli manifestano il carattere senza preferenza di sesso 75% dei figli manifestano il carattere senza preferenza di sesso A a Genotipi: 1/2 Aa, 1/2 aa Fenotipi: 1/2 affetti, 1/2 non affetti Genotipi: 1/4 AA, 1/2 Aa, 1/4 aa Fenotipi: 3/4 affetti, 1/4 non affetti

Espressività Espressività: grado con il quale la malattia è espressa in un individuo al livello di popolazione un fenotipo presenta espressivita’ variabile quando all’interno dell’insieme di soggetti sicuramente portatori il fenotipo presenta gravita’ e/o complessita’ diversa anche all’interno della famiglia ci puo’ essere espressivita’ variabile importanza di un accurato esame clinico esteso ai consanguinei di un affetto, anche apparentemente sani Il tipo e la gravità delle manifestazioni cliniche non sono sempre sovrapponibili negli individui affetti dalla stessa patologia autosomica dominante

mutazioni eterozigoti di PAX3 Waardenburg sordità (o deficit uditivo di vario livello) bilaterale, modifiche nella pigmentazione, sia dei capelli (albinismo parziale, in genere piebaldismo) che della pelle, anomalie nello sviluppo dei tessuti derivati dalla cresta neurale lateralizzazione del canto mediale diverso colore degli occhi (eterocromia), di solito uno marrone e l'altro blu

Espressivita’ variabile SINDROME DI WAARDENBURG Sindrome completa: sordita’ + occhi di colore diverso + ciuffo di capelli bianchi sulla fronte + precoce incanutimento 1 sordità 2 sordità+ occhi di colore diverso 3 sordità+ occhi di colore diverso + ciuffo di capelli bianchi sulla fronte 4 ciuffo di capelli bianchi sulla fronte + precoce incanutimento

esordio variabile il fenotipo puo’ comparire in età avanzata il fenotipo non è congenito pur essendo ereditario dal punto di vista genetico raramente questi fenotipi sono dovuti a nuove mutazioni a livello di popolazione l’allele mutato puo’ essere frequente, purché l’ insorgenza si verifichi dopo l’inizio dell’età riproduttiva e non limiti la fitness (capacita’ di riprodursi)

penetranza proporzione di individui portatori del gene patologico che hanno segni clinici della malattia può dipendere: accuratezza diagnostica (esami clinici e di laboratorio mirati - es. porfiria acuta) età (esordio variabile - es. Corea di Huntington) meccanismo d’azione del gene (retinoblastoma, teoria dei 2 hits di Knudson)

tratti autosomici dominanti penetranza

penetranza la penetranza è un concetto che si riferisce alla popolazione A livello del singolo individuo il carattere ha solo due possibilità si manifesta non si manifesta è presa in considerazione più frequentemente nei caratteri dominanti Sapere che un gene puo’ non essere completamente penetrante, e’ critico per studiarne la genetica o fornire consulenza genetica: un certo soggetto che non manifesta il carattere puo’ essere portatore del gene.

Età di insorgenza della Corea di Huntington Probabilità che un individuo portatore del gene mutato abbia sviluppato i sintomi ad una data età Rischio che il figlio sano di un soggetto affetto sia portatore del gene mutato ad una determinata età.

Penetranza ed espressivita’ La penetranza ridotta non e’ da confondere con l’espressivita’ variabile L’espressivita’ e’ il grado di gravita’con cui fra gli individui che presentano il fenotipo questo si esprime: puo’ costituire un sottoinsieme degli individui “penetranti” Es. Neurofibromatosi: presenza di tumori lungo i nervi periferici e regioni di pigmentazione scura (“macchie di caffelatte”)Tutti i portatori presentano almeno uno dei segni, ma la gravita’ puo’ essere diversa anche all’interno della stessa famiglia: un genitore con macchie e piccoli tumori cutanei benigni puo’ avere un figlio che presenta tumori estesi e maligni. (questa differenza non e’ prevedibile si puo’ solo quantizzare il rischio di ereditare l’allele non il fenotipo)

ipotesi sul rischio di ricorrenza La malattia non è genetica La malattia è dovuta a nuova mutazione dominante: rischi di ricorrenza trascurabili nella prole della coppia La trasmissione è autosomica recessiva: rischio di ricorrenza di 1 su 4 per la futura prole indipendentemente dal sesso La malattia è legata all’X recessiva e la madre può essere o meno portatrice: rischio di ricorrenza di 1 su 2 maschi se la madre è portatrice La malattia è poligenica o cromosomica: rischio di ricorrenza ben definito dipendente dal tipo di malattia

mappaggio genico serve ad identificare la posizione cromosomica di un locus genico possono essere “mappati”: marcatori genetici anonimi, quali brevi sequenze di DNA (dette STS), DNA microsatelliti, ecc. geni loci associati a malattie con trasmissione mendeliana loci associati a predisposizione a malattie con trasmissione nonmendeliana

a cosa serve il mappaggio in genetica medica? per identificare la localizzazione dei geni malattia per fare diagnosi indiretta in una famiglia in cui la mutazione responsabile di una malattia genetica mendeliana non è stata ancora identificata per identificare i geni responsabili della suscettibilità a malattie non mendeliane

per localizzare e identificare geni malattia Linkage mapping

per fare diagnosi indiretta in una famiglia in cui la mutazione responsabile di una malattia genetica mendeliana non è stata ancora identificata

per identificare i geni associati ad una suscettibilità a malattie non mendeliane

Segregazione e crossing-over un figlio riceve un cromosoma da ciascun genitore che è il prodotto finale della ricombinazione meiotica Non è possibile ricevere un cromosoma che non abbia effettuato crossing-over

principi generali del mappaggio si segue la segregazione della patologia nei pedigrees utilizzando marcatori genetici a posizione nota si correla la segregazione della patologia e dei marcatori in più famiglie quanto più spesso la patologia e un marcatore co-segregano tanto più sono vicini *

c’è bisogno di famiglie abbastanza grandi in cui si osserva la trasmissione della patologia

i membri della famiglia devono essere genotipizzati usando marcatori polimorfici marcatori polimorfici sono noti per ogni cromosoma e di ciascuno si conosce esattamente la posizione cromosomica i marcatori più informativi sono quelli che presentano un elevato grado di eterozigosità, perché questo consente di distinguere l’allele paterno dall’allele materno La nomenclatura D20S906 indica che un marcatore di DNA è singolo nel genoma ed è localizzato sul cromosoma 20; purtroppo il numero 906 non ha alcun rapporto con la posizione

Marcatori polimorfici A partire dagli anni ‘80 RFLP: restriction fragment length polymorphisms Nella accezione attuale, il DNA purificato è amplificato con la PCR. Il prodotto della PCR è quindi tagliato in frammenti di restrizione mediante enzimi di restrizione detti endonucleasi, che attuano il taglio unicamente in corrispondenza di particolari sequenze nucleotidiche, specifiche per ogni enzima. I frammenti di restrizione sono separati per lunghezza mediante elettroforesi su gel d'agarosio

RFLP l’enzima di restrizione SmaI taglia l’esanucleotide CCCGGG. La sequenza CCGGGG rende non digeribile il DNA in quella posizione

STR A partire dal 1990 STR: short-tandem repeats or microsatellites e.g. (CAn) gttatcttagggctcagtcacacacacacacacacacacatccaggtattggatcaac Quello che varia tra gli alleli è il numero di ripetizioni dell’elemento. E’ molto più frequente riscontrare individui eterozigoti, con un numero di ripetizioni differente nei due alleli

SNPs single nucleotide polymorphisms Variazioni puntiformi della sequenza tra due copie del genoma Per un SNP un individuo può essere Omozigote T/T o C/C Eterozigote T/C

Variazioni della sequenza del DNA ACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACCGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGAACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGACGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGATAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGACGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGACGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGACGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATTATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGACGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTTATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGACGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGATAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGACGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGACGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCCTCGCGACACACACAGATATATAGCGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGACGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGA Variazioni della sequenza del DNA

Codificanti nonsinonimi 64.382 SNPs nel genoma umano http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/ DB SNP built 128 (23 Oct 2007) Totale 11.751.216 Totale codificanti 111.003 Codificanti sinonimi 46.621 Codificanti nonsinonimi 64.382

Aploblocchi sul sito http://www.hapmap.org

DNA recombination ♁ NR R R Diploid gamete precursor cell NR 22 + 1 22 + 1 A - NR (♂) B - A - - A chr1 2 (22 + 1) 2 (22 + 1) B - - B ♁ Meiosis - A R chr1 ♂ (♂) (♁) ♁ - B A - - A A - - A chr1 B - - B B - - B A - R chr1 chr1 chr1 chr1 (♁) A - - A B - chr1 Diploid gamete precursor cell B - - B - A chr1 NR - B Haploid gamete precursors chr1 Hap. gametes

ricombinanti R e non ricombinanti NR il 50% deve essere R e il 50% NR se i loci sono posti su cromosomi differenti, mentre i NR sono >50% se i loci sono sintenici.

L’analisi della frazione di ricombinazione è alla base del mappaggio la frazione di ricombinazione tra due loci, q, è compresa tra 0 e 0.5 Il valore di q non può mai essere maggiore di 0.5, il che indica che i loci sono posizionati molto lontani o su cromosomi differenti se q è significativamente minore di 0.5 i loci sono “linked” più piccolo è q più vicini sono i loci

l’unità di misura della distanza genetica è il centiMorgan cM La distanza genetica tra due loci è il numero atteso di crossovers per meiosi le distanze piccole sono accurate mentre le grandi sono sottostimate perché un doppio crossover può far pensare a un non ricombinante per valutare distanze grandi occorre sommare distanze piccole per q <10% la correlazione tra q e cM è 1:1 mediamente 1 cM corrisponde a circa 850.000 bp, ma tale valore è inversamente proporzionale alla frequenza di ricombinazione

Le meiosi si visualizzano con MLH1 che è parte del macchinario di ricombinazione Nella meiosi maschile che avviene nei testicoli ci sono circa 51 chiasmi e quindi considerando 50cM per chiasma, il genoma è di 2550 cM Nella meiosi femminile che è più difficile da studiare perché avviene a 16-24 settimane di vita fetale ci sono almeno 70 chiasmi (3500 cM), ma si stimano 4280cM Dal momento che la frequenza di ricombinazione è differente si usa un valore medio tra i due sessi

Il mappaggio per linkage è basato sull’analisi della ricombinazione = affetto = non affetto Locus malattia Marker d d D d 2 5 1 1 1 2 3 4 1 3 1 3 2 4 1 4 2 4 2 3 D = allele patologico d = allele wild-type

1° obiettivo - stabilire la fase d d D d 2 5 1 1 1 2 3 4 1 3 1 3 2 4 1 4 2 4 2 3 Doppio eterozigote

2° obiettivo – contare i ricombinanti d d D d 2 5 1 1 1 2 3 4 1 3 1 3 2 4 1 4 2 4 2 3 recombinanti q = 1/5 NR NR NR NR NR R

lod-score Il lod-score misura le probabilità a favore del linkage Compara la probabilità ad un certo valore di  e la probabilità nel caso non vi sia alcun linkage e quindi che  sia uguale a 0.5 LOD = log of the odds Z() = log10 [L()/L(0.5)]

3° obiettivo – calcolare il LOD score d d D d 2 5 1 1 1 2 3 4 1 3 1 3 2 4 1 4 2 4 2 3 NR NR NR NR NR R LOD SCORE (LOD) Z = log10  R ( 1- ) NR = log10  ( 1- ) 5 0.5 (R+NR) 0.5 6

Il metodo La probabilità L(q) è calcolata per i differenti valori di q tra 0 e 0.5 Un rapporto tra le probabilità è calcolato LR(q) = L(q)/L(0.50) Il lod-score è il logaritmo in base 10 (log10) del rapporto tra le probabilità Z(q) = log10[L(q)/L(0.50)] La migliore stima della frazione di ricombinazione è il valore di q a cui Z(q) è massimo (MLS)

Per le patologie a trasmissione mendeliana Z() >> 3  si accetta il linkage per un carattere autosomico Z() >>2  si accetta il linkage per un carattere X-linked Z() < -2  si respinge definitivamente l’ipotesi di linkage per un particolare valore di  Z() > -2 ma < 3  occorrono ulteriori studi

linked, no recombination

Link utile http://linkage.rockefeller.edu