TOSSICOLOGIA EPATICA Cause di vulnerabilità: 1. Funzione prioritaria 27/03/2017 TOSSICOLOGIA EPATICA Cause di vulnerabilità: 1. Funzione prioritaria 2. Organizzazione strutturale 3. Funzione escretoria

tossicologia epatica 27/03/2017 TOSSICOLOGIA EPATICA Anatomicamente è suddiviso in lobuli esagonali orientati attorno alle vene epatiche terminali (vene centrali) All’angolo del lobulo si trova il tratto portale, formato da: 1. un ramo della vena porta 2. un’arteriola epatica 3. un dotto biliare

TOSSICOLOGIA EPATICA Il lobulo è suddiviso in tre regioni: 27/03/2017 TOSSICOLOGIA EPATICA Il lobulo è suddiviso in tre regioni: 1. Centrolobulare 2. Mediozonale 3. Periportale

tossicologia epatica 27/03/2017 TOSSICOLOGIA EPATICA Il concetto di acino viene preferito come unità funzionale ed è suddiviso anch’esso in tre zone che coincidono con quelle del lobulo.

tossicologia epatica 27/03/2017 TOSSICOLOGIA EPATICA Il sangue che entra nell’acino proviene per il 60-70% dalla vena porta (povero di ossigeno) e per il 30-40% dall’arteria epatica (ossigenato)

TOSSICOLOGIA EPATICA La concentrazione di ossigeno è di: 27/03/2017 TOSSICOLOGIA EPATICA La concentrazione di ossigeno è di: 9-13% nella zona 1 4-5% nella zona 3

tossicologia epatica 27/03/2017 TOSSICOLOGIA EPATICA Gli epatociti della zona 1, ricchi in mitocondri, hanno le seguenti funzioni: 1. Ossidazione degli acidi grassi 2. Gluconeogenesi 3. Detossificazione dell’amoniaca a urea

tossicologia epatica 27/03/2017 TOSSICOLOGIA EPATICA Nella zona 1 vi è una elevata concentrazione in Glutatione ridotto Nella zona 3 vi è una elevata attività del Citocromo P-450, in particolare dell’isoforma 2E1

tossicologia epatica 27/03/2017 TOSSICOLOGIA EPATICA I sinusoidi sono canali tra le corde degli epatociti ove il sangue percola fino alla vena epatica terminale.

TOSSICOLOGIA EPATICA Tre sono i tipi di cellula più importanti: 27/03/2017 TOSSICOLOGIA EPATICA Tre sono i tipi di cellula più importanti: 1. Cellule endoteliali 2. Cellule di Kupfer 3. Cellule di Ito

TOSSICOLOGIA EPATICA CELLULE ENDOTELIALI 27/03/2017 TOSSICOLOGIA EPATICA CELLULE ENDOTELIALI Sono fondamentali come “scavenger” delle lipoproteine e delle proteine denaturate. Secernono citochine.

TOSSICOLOGIA EPATICA CELLULE DI KUPFER 27/03/2017 TOSSICOLOGIA EPATICA CELLULE DI KUPFER Sono macrofagi stanziali e costituiscono l’80% dei macrofagi non circolanti dell’organismo. Sono presenti nel lumen dei sinusoidi e la loro funzione primaria è di ingerire e degradare materiale particolato. Sono una fonte di citochine e possono agire come cellule presentanti antigeni.

TOSSICOLOGIA EPATICA CELLULE DI ITO 27/03/2017 TOSSICOLOGIA EPATICA CELLULE DI ITO Sono note anche come cellule del grasso e cellule stellate e sono localizzate nello spazio di Disse tra le cellule endoteliali e gli epatociti. Sintetizzano il collagene e sono il sito di maggior immagazzinamento di vitamina A dell’intero organismo.

TOSSICOLOGIA EPATICA FORMAZIONE DELLA BILE 27/03/2017 TOSSICOLOGIA EPATICA FORMAZIONE DELLA BILE La bile è un fluido che contiene: acidi grassi glutatione fosfolipidi colesterolo bilirubina anioni organici, proteine, metalli

TOSSICOLOGIA EPATICA FORMAZIONE DELLA BILE 27/03/2017 TOSSICOLOGIA EPATICA FORMAZIONE DELLA BILE Gli epatociti iniziano il processo trasportando gli acidi biliari, il glutatione e altri soluti nel lumen canalicolare, spazio formato da regioni specializzate della membrana plasmatica tra epatociti adiacenti.

TOSSICOLOGIA EPATICA FORMAZIONE DELLA BILE 27/03/2017 TOSSICOLOGIA EPATICA FORMAZIONE DELLA BILE I canalicoli formano canali tra gli epatociti che mettono in connessione con una serie di canali o dotti più larghi nel fegato. I dotti biliari extraepatici sfociano nel dotto comune biliare.

TOSSICOLOGIA EPATICA FORMAZIONE DELLA BILE 27/03/2017 TOSSICOLOGIA EPATICA FORMAZIONE DELLA BILE La bile può essere immagazzinata e concentrata nella colecisti prima di essere secreta nel duodeno. La colecisti è assente in alcune specie di mammiferi quali: ratto cavallo balena

TOSSICOLOGIA EPATICA FORMAZIONE DELLA BILE 27/03/2017 TOSSICOLOGIA EPATICA FORMAZIONE DELLA BILE Trasportatori sono presenti nei sinusoidi e sulle membrane canalicolari degli epatociti e sono responsabili dell’accumulo di acidi biliari e bilirubina dal sangue e della loro secrezione nel lumen canalicolare. Processi attivi sono determinanti per l’ingresso di altri importanti costituenti della bile.

TOSSICOLOGIA EPATICA FORMAZIONE DELLA BILE 27/03/2017 TOSSICOLOGIA EPATICA FORMAZIONE DELLA BILE Metaboliti dei leucotrieni, fosfolipidi, estrogeni e molti farmaci sono trasportati attraverso la membrana canalicolare da proteine note come: Multiple Organic Anion Transporter (MOAT) Multi-drug-resistant (MDR) P-glicoproteins

TOSSICOLOGIA EPATICA FORMAZIONE DELLA BILE 27/03/2017 TOSSICOLOGIA EPATICA FORMAZIONE DELLA BILE Fluidi e anioni entrano nella bile per diffusione paracellulare, transcitosi e endocitosi. I metalli sono escreti nella bile da una serie di processi (non tutti noti) e l’escrezione biliare è importante nell’omeostasi di Cu, Mn, Fe, Zn, Au, Al e Hg.

TOSSICOLOGIA EPATICA FORMAZIONE DELLA BILE 27/03/2017 FORMAZIONE DELLA BILE meccanismi di escrezione nella bile dei metalli: 1. Passaggio attraverso la membrana sinusoidale per diffusione facilitata o endocitosi mediata da recettori 2. Immagazzinamento mediante proteine leganti o lisosomi 3. Secrezione nei canalicoli via lisosomi, meccanismi accoppiati al glutatione o specifici trasportatori della membrana canalicolare

CLASSIFICAZIONE MORFOLOGICA tossicologia epatica TOSSICOLOGIA EPATICA 27/03/2017 CLASSIFICAZIONE MORFOLOGICA Popper & Schaffner, 1959 1. Alterazioni epatocellulari senza reazione infiammatoria (Tipo I: necrosi e steatosi) 2. Colestasi intraepatica (Tipo II) 3. Necrosi epatica con reazione infiammatoria (Tipo II: epatite virale) 4. Non classificate 5. Epatocarcinoma

tossicologia epatica TOSSICOLOGIA EPATICA 27/03/2017 LINEE GUIDA EPATOTOSSICITA’ DA FARMACI E SOSTANZE CHIMICHE U.S. Public Health Service 1979 Tipo I: prevedibile dose e tempo dipendente presente nella maggior parte degli esposti riproducibile nell’animale Tipo II: non prevedibile indipendente dal tempo e dalla dose sporadica non riproducibile nell’animale

TOSSICOLOGIA EPATICA TIPI DI DANNO EPATICO 1. STEATOSI 2. MORTE DELL’EPATOCITA 3. COLESTASI CANALICOLARE 4. DANNO DEI DOTTI BILIARI 5. CIRROSI 6. DISORDINI VASCOLARI 7. TUMORI

MECCANISMI DI DANNO ZONALE tossicologia epatica TOSSICOLOGIA EPATICA 27/03/2017 MECCANISMI DI DANNO ZONALE sostanza meccanismo spiegazione Zona 1 sovraccarico di Fe perossidazione lipidica zona 1 contiene più Fe della zona 3 alcool allilico ossidazione ad acroleina zona 1 contiene più O2 Zona 3 CCl4 attivazione da parte del zona 3 ha più Cit. P-450 Cit. P-450 a radicale libero e meno O2 CCl3 Acetaminofene sbilanciamento tra attivazione zona 3 ha più Cit. P-450 Cit. P-450 e detossificazione e meno GSH del GSH

TOSSICOLOGIA EPATICA H2O2  2H2O + O2 ROOH + 2 GSH  ROH + H2O + GSSG  + 2H+  H2O2 + O2 radicale superossido catalasi H2O2  2H2O + O2 GSH perossidasi ROOH + 2 GSH  ROH + H2O + GSSG Reazione di FENTON Fe2+ + H2O2  Fe3+ + OH + OH- radicale idrossilico

TOSSICOLOGIA EPATICA STEATOSI Viene definita come un aumento del contenuto in lipidi maggiore del 5% del peso 1. Eccesso di grassi liberi veicolati al fegato 2. Interferenza col ciclo dei trigliceridi 3. Aumento della sintesi o esterificazione degli acidi grassi 4. Riduzione nella ossidazione degli acidi grassi 5. Riduzione nella sintesi di apoproteine 6. Diminuzione della sintesi o secrezione di VLDL

TOSSICOLOGIA EPATICA MORTE DELL’EPATOCITA Necrosi  rigonfiamento cellulare rottura cellulare disintegrazione nucleare diffusione di cellule infiammatorie Apoptosi  restringimento cellulare frammentazione nucleare formazione di corpi apoptotici assenza di infiammazione segue

TOSSICOLOGIA EPATICA MORTE DELL’EPATOCITA La morte dell’epatocita può avvenire con aspetto: 1. Focale: caratterizzata da una distribuzione randomizzata di singoli epatociti o piccoli “cluster” di epatociti morti 2. Zonale: predominante in zona 1 (periportale) o 3 (centrolobulare) 3. Panacinare: morte massiva di epatociti con pochi sopravvisuti segue

COLESTASI CANALICOLARE TOSSICOLOGIA EPATICA COLESTASI CANALICOLARE Definita come: 1. riduzione nel volume della bile 2. ridotta secrezione di specifici soluti nella bile

DANNO DEI DOTTI BILIARI (COLESTASI COLANGIODISTRUTTIVA) TOSSICOLOGIA EPATICA DANNO DEI DOTTI BILIARI (COLESTASI COLANGIODISTRUTTIVA) 1. Rigonfiamento dell’epitelio biliare 2. Presenza di detriti di cellule danneggiate nel lumen duttale 3. Infiltrazione di cellule infiammatorie dal tratto portale segue

DANNO DEI DOTTI BILIARI (COLESTASI COLANGIODISTRUTTIVA) TOSSICOLOGIA EPATICA DANNO DEI DOTTI BILIARI (COLESTASI COLANGIODISTRUTTIVA) La somministrazione cronica di tossine che causano distruzione dei dotti biliari può portare alla loro proliferazione e alla fibrosi con esito in cirrosi biliare. Altro possibile effetto è la perdita di dotti biliari, nota come sindrome del dotto biliare evanescente. segue

DANNO DEI DOTTI BILIARI (COLESTASI COLANGIODISTRUTTIVA) TOSSICOLOGIA EPATICA DANNO DEI DOTTI BILIARI (COLESTASI COLANGIODISTRUTTIVA) Un caso celebre è quello noto come ittero di Epping, villaggio inglese, i cui abitanti hanno consumato prodotti provenienti da suolo contaminato con dianilina di metilene, composto usato per la produzione di resine epossidiche

TOSSICOLOGIA EPATICA CIRROSI E’ l’esito terminale di un danno cronico nel quale un esteso tessuto fibroso (collagene) viene depositato come risposta all’insulto diretto o all’infiammazione. E’ quindi la presenza massiva di tessuto cicatriziale attorno a noduli formati da epatociti rigenerati. E’ irreversibile.

TOSSICOLOGIA EPATICA DISORDINI VASCOLARI Possono essere interessati i sinusoidi o i grandi vasi. Sinusoidi: allargamento delle finestre con intrappolamento degli eritrociti in esse o nello spazio di Disse. Conseguenza: infarcimento epatico con ipoafflusso periferico. segue

TOSSICOLOGIA EPATICA DISORDINI VASCOLARI Altre forme: malattia veno-occlusiva che risulta dalla ostruzione non trombotica delle venule epatiche terminali o delle vene intraepatiche più piccole. Un potenziale aspetto della patogenesi è la distruzione dell’endotelio delle venule epatiche.

TOSSICOLOGIA EPATICA TUMORI 1. a carico degli epatociti 2. a carico dei sinusoidi 3. epatocarcinoma  androgeni e aflatossine 4. angiosarcoma  CVM, arsenico, torio

TOSSICOLOGIA EPATICA Steatosi CCl4, etanolo, ac. valproico Morte cellulare acetaminofene, Cu, DMF, etanolo, Fe, microcistina Colestasi canalicolare cloropromazina, ciclosporina A, 1,1,-dicloretilene, estrogeni, etanolo, Mn, falloidina Danno dei dotti biliari ANIT (-naftilisotiocianato), dianilina di metilene Cirrosi As, etanolo, vitamina A Disordini vascolari As, dacarbazina, microcistina Tumori aflatossine, androgeni, torio, CVM

MECCANISMI DI COLESTASI TOSSICOLOGIA EPATICA MECCANISMI DI COLESTASI 1. Falle nelle giunzioni paracellulari: queste forniscono una notevole barriera (carica) alla diffusione di soluti tra sangue e lumen canalicolare, mentre acqua e piccoli ioni diffondono liberamente. -Naftilisotiocianato (ANIT) causa falle nelle giunzioni

ANIT falloidina colchicina ciclosporina A Mn

MECCANISMI DI COLESTASI TOSSICOLOGIA EPATICA MECCANISMI DI COLESTASI 2. Rottura della struttura o 3. dell’integrità funzionale del citoscheletro: interferenze nella formazione della bile diminuendo la velocità e la forza di contrazione canalicolare o la velocità di transcitosi attorno agli epatociti. Falloidina (2) si lega ai microfilamenti dell’actina del citoscheletro e rallenta la contrazione canalicolare in maniera dose-dipendente. Colchicina (3) inibisce la polimerizzazione della tubulina nei microtubuli, inibisce la secrezione di proteine nella bile, diminuendo la transcitosi microtubulo-dipendenti delle vescicole.

ANIT falloidina colchicina ciclosporina A Mn

MECCANISMI DI COLESTASI TOSSICOLOGIA EPATICA MECCANISMI DI COLESTASI 4. Inibizione dei trasportatori coinvolti nella formazione della bile. Ciclosporina A causa inibizione del trasporto con aumento degli acidi grassi e della bilirubina nel siero e riduzione del flusso biliare. 5. Concentrazione di forme reattive di sostanze tossiche nell’area pericanalicolare. I canalicoli sono ricchi in Cit. P.-450, ma poveri in GSH e GST con sbilanciamento tra bioattivazione e detossificazione. Mn, 1,1,-Dicloroetilene, Diclofenac

ANIT falloidina colchicina ciclosporina A Mn

MECCANISMI DI COLESTASI TOSSICOLOGIA EPATICA MECCANISMI DI COLESTASI Sono possibili anche più meccanismi contemporaneamente: Cloropromazina altera sia la contrattilità canalicolare (2) sia il trasporto attivo di acidi grassi (4) Estrogeni alterano il trasporto degli acidi grassi per effetto sulle membrane dei sinusoidi, inclusa la riduzione della Na/K ATPasi e modificano la componente lipidica della membrana plasmatica. Riducono il numero dei trasportatori degli acidi biliari.

ATTIVAZIONE DELLE CELLULE SINUSOIDALI TOSSICOLOGIA EPATICA ATTIVAZIONE DELLE CELLULE SINUSOIDALI La risposta agli effetti acuti di numerose tossine può essere modificata dalla precedente esposizione ad altre sostanze con effetto sui sinusoidi. La tossicità dell’acetaminofene potrebbe essere aumentata o diminuita da sostanze che attivano o inattivano le cellule di Kupfer. Allo stesso modo, la vitamina A causa un importante aumento della necrosi epatica indotta dal CCl4 attraverso il rilascio di specie reattive dell’ossigeno. Sostanze tossiche potrebbero stimolare la produzione di collagene da parte delle cellule di Ito.

INDUZIONE ENZIMATICA Effetto sull’attività degli enzimi microsomiali da parte di alcune sostanze xenobiotiche. Consiste in una aumentata attività di tali enzimi con aumentato metabolismo delle sostanze endogene e xenobiotiche.

INDUZIONE ENZIMATICA RECETTORE DI INDUZIONE: prodotto di un gene regolatore che, combinandosi con una molecola a basso P.M. dà inizio all’espressione di un altro gene che controlla la biosintesi dell’enzima

INDUZIONE ENZIMATICA L’effetto degli induttori enzimatici può essere: POLIVALENTE  DDT, fenobarbital (in grado di indurre una vasta gamma di enzimi) SELETTIVO  benzopirene (in grado di indurre il metabolismo di sostanze della stessa classe)

INDUZIONE ENZIMATICA Toluene, Xilene DDT, Aldrin, Dieldrin TCDD Benzopirene, Metilcolantrene Bifenilipoliclorurati Fenilbutazone Fenobarbital Etanolo (effetto cronico) Difenilidantoina

INDUZIONE ENZIMATICA TEST in vivo sull’animale: 1. sleeping time (tempo di sonno indotto dal fenobarbital) 2. tempo di paralisi indotto dalla zoxazolamina normale 730 minuti fenilbutazone 307 minuti fenobarbital 102 minuti benzopirene 17 minuti

INDUZIONE ENZIMATICA TEST in vivo sull’uomo: 1. dosaggio 6-ß-idrossicortisolo urinario (aumentato) 2. dosaggio acido D-glucarico urinario (aumentato) 3. dosaggio attività GGT sierica (aumentata) 4. Determinazione dell’emivita dell’antipirina (ridotta)

INDUZIONE ENZIMATICA TEST in vitro sull’animale: 1. dosaggio delle attività enzimatiche microsomiali (idrossilazione dell’anilina per i substrati di tipo II, demetilazione dell’aminopirina per i substrati di tipo I) 2. dosaggio attività citocromo P-450 dopo somministrazione di induttori

INIBIZIONE ENZIMATICA Effetto opposto a quello dell’induzione enzimatica.

INIBIZIONE ENZIMATICA SKF 525 A (ß-dietilaminoetildifenilpropilacetato) Tetracloruro di carbonio (attivivazione “suicida”) Ozono Monossido di carbonio Metalli (Cd, Co, Pb, Se) Etanolo (effetto acuto) Desmetilimipramina