Array di oligonucleotidi Questo tipo di array si ottiene sia con la sintesi diretta di oligonucleotidi sul supporto oppure per e la microdeposizione di gocce di oligonucleotidi sul supporto; si può raggiungere una densità di 100.000 oligonucleotidi/per vetrino (da 20 a 60 basi). Offrono vantaggi rispetto ai microarray e ai macroarray perché sono in grado di svelare SNPs e di distinguere quindi tra sequenze molto simili tra loro

DNA Chips o microarrays di oligonucleotidi: metodo sviluppato dalla Affymetrix Inc. Il sistema della sintesi diretta degli oligonucleotidi sul chip è stato sviluppato dalla Affymetrix Inc.: Gli oligonucleotidi sono sintetizzati in situ sul substrato in posizioni definite. Funziona con migliaia di transistor in un singolo circuito integrato per produrre serie ordinate di oligo -> i Gene Chips che hanno dimensioni di un francobollo (1,6 cm2) con una densità di circa 106 oligo per cm2. Le sequenze di un set di oligonucleotidi di DNA lunghi fino a 25 basi sono determinate in base all’esperimento. Un algoritmo di calcolo disegna delle maschere litografiche da utilizzare per sintetizzare la serie di oligo sui chips. Gli array sono costruiti in base ad un procedimento chimico diretto dalla luce (http://affymetrix.com) Fonte luminosa MASCHERA LITOGRAFICA SUPPORTO

Metodo della Affymetrix Fonte luminosa MASCHERA LITOGRAFICA SUPPORTO Luce -> DEPROTEZIONE MASCHERA LITOGRAFICA SUBSTRATO Accoppiamento chimico T- Nuovo gruppo di protezione fotolabile Luce -> DEPROTEZIONE MASCHERA LITOGRAFICA SUBSTRATO C- Il procedimento è ripetuto

Un nuovo approccio per i microarray di nucleotidi viene dalla tecnologia delle fibre ottiche, è possibile creare 50000 pozzetti all’estremità di una fibra ottica di 1 mm di diametro. 50000 per linea ognuna con un diverso oligonucleotide possono essere messe in questi pozzetti e usate per sondare un campione bersaglio, SNP o pattern di espressione genica. Gli strumenti correnti usano 96 fibre ottiche e quindi si possono analizzare contemporaneamente più di 5.000.000 di situazioni diverse ad ogni esperimento

Esempio di microarray di oligonucleotidi per analisi differenziale dei trascritti tra popolazioni cellulari differenti 1 cm cDNAottenuto da RNA da tessuto sano cDNA ottenuto da RNA da tessuto tumorale Supporto in vetro, silicio o fibre ottiche Segnale VERDE se un gene è espresso per esempio solo nel tessuto sano, ROSSO se un gene è espresso solo nel tessuto tumorale e diverse gradazioni di GIALLO (rosso + verde) se un gene è espresso in entrambi i tessuti.

Uso di un microarray di oligonucleotidi per identificare SNPs Il gene BRCA1 è coivolto nello sviluppo del tumore al seno e alle ovaie Nel 1994 è stato clonato il gene BRCA1, un gene oncosoppressore situato sul cromosoma 17 Una serie di mutazioni in questo gene sono state riscontrate prevalentemente in soggetti affetti da carcinoma mammario od ovarico, di tipo familiare Il BRCA1 risulta essere implicato in una serie di funzioni cellulari di primaria importanza come la riparazione del DNA, la regolazione della trascrizione, il controllo del ciclo cellulare e l’ubiquitinazione Nei soggetti portatori di questo tipo di mutazione il rischio di sviluppare un carcinoma mammario nell’arco della vita è compreso tra il 50 e l’85%; per il carcinoma ovarico il rischio è del 15-60% Le mutazioni identificate sono più di 600 e quasi tutte comportano la produzione di una proteina tronca alcune di esse sono più frequenti di altre all’interno di una popolazione Una donna su 500-800 è portatrice di una mutazione del BRCA1. È stato messo a punto un test di screening per identificare mutazioni (SNPs) in qualsiasi posizione del gene, anche se al momento molto costoso.

Analisi per ASO multipla su larga scala per identificare SNPs nel gene BRCA 1 La regione BRCA 1 codificante è lunga 5500 bp. Per identificare una mutazione posta in una qualsiasi delle posizioni nella sequenza, si disegnano 4 ASO di sequenza identica per OGNI POSIZIONE NUCLEOTIDICA -> 22000 oligonucleotidi in tutto Gli oligo così ottenuti sono fissati ad un supporto, in modo permanente -> MICROARRAY

Analisi per ASO multipla su larga scala per identificare SNPs nel gene BRCA 1 La regione BRCA 1 codificante è lunga 5500 bp. Per identificare una mutazione posta in una qualsiasi delle posizioni nella sequenza, si disegnano 4 ASO di sequenza identica per OGNI POSIZIONE NUCLEOTIDICA -> 22000 oligonucleotidi in tutto Gli oligo così ottenuti sono fissati ad un supporto, in modo permanente -> MICROARRAY Le sonde (gli oligonucleotidi) sono attaccate al supporto e costituiscono il microarray ed è il DNA da saggiare ad essere marcato. Si amplifica il DNA dal soggetto in esame mediante PCR Si marca l’amplificato con un colorante fluorescente Si ibrida al microarray, usando condizioni che permettono l’ibridazione di piccole sequenze (gli oligo) perfettamente complementari Si analizza il risultato dell’ibridazione mediante analisi computerizzata per identificare eventuali differenze rispetto ad un campione amplificato da un individuo omozigote per l’allele normale del gene BRCA 1

Confronto di due microarray tra la posizione 2420 e 2440 del gene BRCA 1 con DNA da individui con genotipo che differisce per un singolo nucleotide in posizione 2431 T G C A C A G T A T T T C A T T G G T A C C T G G 2420 2440 Individuo OMOZIGOTE per l’allele normale di BRCA 1 Il DNA AMPLIFICATO e MARCATO ottenuto, può essere complementare con tutte le sue basi SOLO ad un ASO presente in ogni colonna del microarray. T G C A C A G T A T T T C A T T G G T A C C T G G 2420 2440 Individuo ETEROZIGOTE per l’allele normale di BRCA 1 e un allele con SNP in posizione 2430