Canali “senza porta” (non gated) o canali di “leakage” Sono presenti in tutte le membrane cellulari. Sono sempre nello stato aperto. Il flusso di ioni che li attraversa è detto “leakage” (perdita) perché tende a cancellare i gradienti ionici creati ai due lati delle membrane dai trasporti attivi. Sono i responsabili della conduttanza di fondo delle membrane (leakage conductance) che, essendo diseguale per le diverse specie ioniche, gL=gNa,L+gK,L+gCl,L+gCa,L (gNa,L≠gK,L≠gCl,L≠gCa,L) genera quel fondamentale potenziale di diffusione che è il potenziale di membrana a riposo (resting potential). Esistono canali di leakage (“leakage channels” o “resting channels”) per i tre ioni più diffusi nei liquidi organici: Na+, K+, Cl-. Non se ne sa molto, perché sono stati studiati molto meno dei VOC e dei ROC

limitare i gradienti ionici creati dalle pompe ioniche, Oltre ad essere fondamentali nel generare il potenziale di membrana a riposo, i canali di leakage hanno un importante finalismo: limitare i gradienti ionici creati dalle pompe ioniche, che di per sé tenderebbero ad aumentarli fino a livelli eccessivi.

1 - Canali del Na+ “epiteliali” (ENaC) Il nome viene dal fatto che i dati sulla struttura di questi canali vengono quasi esclusivamente da quelli presenti nell’epitelio dei tubuli renali (successivamente anche del colon e degli alveoli polmonari), ma si ritiene che siano presenti in tutte le cellule, dove darebbero un contributo al leakage di Na+. Denominazioni alternative: Sodium channels non-neuronal-1 (SCNN1) e Amiloride-sensitive Sodium channel (ASSC). Oltre che al Na+, il canale è anche permeabile al Li+ ed ai protoni (H+)

La molecola è costituita da tre subunità (α, β e γ), codificate da geni distinti. Stechiometria: α2β2γ2. Ogni subunità (ca. 700 aa) comprende due segmenti transmembranari ed un loop extracellulare. Ambedue le estremità (-N e –C) pescano nel citosol. Sono insensibili alla TTX Sono sensibili all’amiloride, che viene impiegata in Medicina come diuretico. Importanti per il riassorbimento dell’acqua nel tratto distale dei tubuli renali e nel colon (dove la sua espressione è stimolata dall’aldosterone e dall’ADH). Sono anche presenti: nella membrana baso-laterale dei barocettori aortici. nei recettori gustativi dell’epitelio linguale, (rivelazione degli stimoli salati (Na+) ed acidi (H+). nel pancreas, nell’ovaio e nel testicolo (funzione ignota).

2. Canali del K+ di tipo “leak” (o “2P”) Vedremo che quella dei canali del K+ è una famiglia straordinariamente numerosa. Questo è l’ultimo gruppo individuato. È formato da due subunità disposte in tandem per formare il poro. Ogni subunità è costituita da 4 STM, con 2 regioni-P. In un primo tempo sono stati descritti 4 membri del gruppo (TWIK, TREK, TASK e TRAAK), ma poi si è visto che sono 15. Uno è sensibile al pH extracellulare, un altro è sensibile all’ac. arachidonico.

3. Canali cationici Praticamente tutte le cellule sono dotate di canali cationici (che escludono il Cl- ma lasciano passare tutti i cationi). Attraverso questi canali (quando siano aperti) entrano Na+ e Ca2+, il K+ esce. La corrente netta è entrante [I(Na+Ca)inw > I(K)ou]. il potenziale d’inversione è attorno allo zero. NB I canali cationici sono la principale via di leakage per il Ca2+.

4. Canali del Cl- (CLC) Sono presenti in tutte le cellule, ma sono numerosissimi nell’organo elettrico della Torpedine (e di altri “pesci elettrici”), dove sono addensati nella membrana ventrale (non nervosa) delle elettoplacche. Qui la presenza dei canali CLC ha il significato di stabilire un contatto a bassissima impedenza tra le elettroplacche (che sono appilate, disposte in serie), per consentire lo straordinario flusso di corrente (dell’ordine degli Ampère !) che le attraversa durante la scarica dell’organo elettrico. E’ appunto dall’organo elettrico di Torpedo che è stata estratta e purificata la proteina costitutiva di questi canali, denominata CLC-0. NB. Dall’organo elettrico sono stati purificati (e poi clonati per la prima volta) anche i recettori-canale nicotinici.

I canali del Cl- (CLC) sono stati i primi canali clonati, ma hanno strutture molecolari atipiche rispetto al modulo “classico”. La molecola è configurabile in 13 α-eliche (D1-D13), molte delle quali (ma non tutte !) sono STM. CLC-0 è il capostipite di una grande famiglia di proteine simili, presenti nelle membrane cellulari di tutti i tessuti.

- CLC-1 è l’isoforma abbondantemente espressa nel muscolo scheletrico, le cui fibrocellule infatti hanno una elevata gCl Una mutazione di questa proteina dà la miotonia, riconducibile alla riduzione della conduttanza al Cl-: vistosa ipertrofia ed ipereccitabilità muscolare, paradossalmente associate a diminuita capacità contrattile. - CLC-2 è presente in svariati tessuti. - CLC-K1 e CLC-K2 sono tipiche del tubulo renale (Kidney), dove consentono il riassorbimento del Cl- dall’ultrafiltrato (al seguito del Na+, riassorbito attivamente). .

5. Canali CFTR Questi “canali” (o trasportatori?) del Cl- sono stati particolarmente studiati, perché il loro malfunzionamento per errore genetico (ereditario) causa una grave malattia particolarmente diffusa nei Paesi nord-europei: la fibrosi cistica o mucoviscidosi. La sigla sta per “Cystic Fibrosis Transmembrane (conductance) Regulator”, il nome che è stato dato alla proteina associata alla malattia. CFTR è una grossa molecola proteica (ca. 1500 aa.) con due domini transmembranari (Membrane Sub Domain) (MSD1 e MSD2), ognuno dei quali à costituito da 6 STM (M1..M6, M7..M12). Ognuno dei due MSD è seguito da un dominio intracellulare predisposto per legare l’ATP: (Nucleotid Binding Domain) NBD1 e NBD2. Questi contengono una particolare sequenza “ABC”: ATP Binding Cassette). Inoltre, nell’ansa intracellulare centrale della molecola, è presente un dominio regolatore (R) che contiene punti di fosforilazione.

CFTR è un canale ionico attivato per via fosforilativa (dalla PKA, AMPc-dipendente). Nello stato defosforilato il canale è chiuso; quando uno solo dei NBDs è fosforilato, il canale attraverserebbe periodi di apertura brevi, e periodi di apertura lunghi quanto tutti e due i NBDs sono fosforilati. La forma più comune di Fibrosi Cistica (70% dei casi) è dovuta alla delezione di una Phe in posizione 508 (all’interno di NBD1). La fibrosi cistica ha esito molto spesso fatale nei primi mesi di vita. Consiste in un’aumentata viscosità di tutti i secreti esocrini, che diventano poveri di acqua (e ricchi di Cl-); ciò ostacola il normale flusso dei secreti nei dotti ghiandolari, facilitando anche l’insorgenza di infezioni. Particolarmente gravi sono gli effetti sulla secrezione mucosa delle vie respiratorie (compromissione della ventilazione alveolare) e sulla secrezione esocrina del pancreas (compromissione della digestione, quindi dell’assorbimento, dei grassi e delle proteine). La diagnosi precoce si può fare misurando la concentrazione del Cl- nel sudore del neonato.

3. La Proteina Codificata dal Gene della Fibrosi Cistica: Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) Un canale Cl- 2 insiemi di 6 domini transmembrana 2 “cassette di legame per l’ATP” (“proteina di trasporto ABC ”) N C dominio-R Cl- est int ATP ATP

protein kinasi A cAMP-dipendente CFTR è un canale al Cl- attivato dalla fosforilazione e dall’idrolisi dell’ATP est dominio-R int N ATP ATP protein kinasi A cAMP-dipendente C

Cl- est int N dominio-R C CFTR è un canale al Cl- attivato dalla fosforilazione e dall’idrolisi dell’ATP Cl- est int N ADP ADP dominio-R C

4. CFTR aiuta a controllare il flusso di acqua attraverso gli epiteli - particolarmente importante è questo processo a livello degli epiteli polmonari - Na+ Na+ 1. I canali al Na+ degli epiteli sono di solito aperti, ma un intenso flusso di Na+ richiede un controione. 3. l’acqua quindi fluisce attraverso le cellule per mantenere la pressione osmotica costante. acqua Cl- Cl- lume superfice “apicale” 2. Se il CFTR è aperto, il Cl- diventa il controione. Quindi NaCl fluisce attraverso la membrana nel lume. 4. Risultato: una soluzione isotonica di NaCl fluisce dal sangue al lume* (o vice-versa) La superfice “basale” (rivolta verso il sangue) è normalmente molto permeabile agli ioni * nel caso degli epiteli polmonari ciò diluisce il muco favorendo gli scambi respiratori

5. Cosa c’è di sbagliato nel DF508? dominio-R Cl- est int La mutazione più comune (70% dei mutanti): una delezione di un singolo codon (3-nt) in posizione 508 nella ATP-binding cassette #1. Una fenilalanina è deleta.

CFTR-DF508 normalmente non raggiunge la membrana plasmatica; WT CFTR