Modelling crescita microbica

La crescita microbica Cosa è la crescita microbica? Valutiamo Cellule totali (microscopio) “Corpuscoli” (Coulter counter, OD) Cellule vive (FACS, microscopio) Biomassa (peso secco) Cellule proliferanti (UFC) Attività metabolica (NADH, ATP,…)

Può esistere crescita disgiunta dalla duplicazione? Biomassa Può esistere crescita disgiunta dalla duplicazione?

Modelli cinetici Utilità del modelling: una descrizione quantitativa dei processi cellulari permette l’ottimizzazione dei processi fermentativi. Resa e produttività sono due parametri misurabili, ma è molto più difficile predire come un cambio delle condizioni operative li possa modificare. La predizione è permessa da un modello matematico, ossia da una serie di relazioni tra le variabili del sistema. Relazioni: equazioni matematiche, espressioni logiche Variabili: agitazione, feed-rate, pH, temperatura, [S], [P], biomassa

Disegno del modello Dipende dall’uso: decidere il numero di reazioni da considerare e la loro stechiometria Kinetic expressions: le velocità delle reazioni considerate dal modello dipendono dalle variabili. Mass balance equations: descrivono come la materia entra, viene trasformata ed esce dal volume considerato (bioreattore); descrivono come cambiano nel tempo le concentrazioni. Simulazione del processo (assegnare parametri) Comparazione dati sperimentali Fitting dei parametri sperimentali (minimizzare la somma dei quadrati degli errori)

“As simple as possible but not simpler” Complessità modello Complessità descrizione metabolismo e comportamento asincrono Modelli non strutturati biomassa Modelli strutturati Volume cellulare, età Compartimentazione reazioni; dettaglio reazioni enzimatiche Non strutturati Non segregati Strutturati Non segregati Descrizione popolazione Non strutturati Segregati Strutturati Segregati Descrizione cellule “As simple as possible but not simpler”

Modello più semplice di crescita Fissione batterica binaria in mezzo omogeneo Generazione Tempo di generazione Crescita asincrona, media dei tempi Modalità batch, fbatch e continua

Crescita in batch 4 fasi classiche Terminata la latenza, aumento della velocità di crescita fino alla vmax Descrizione: numero di cellule o biomassa

Valutazione biomassa La massa aumenta con un processo autocatalitico. dX/dt=mX m = velocità di crescita specifica Volendo determinare m, integriamo: Xt=X0e m t Passando ai logaritmi naturali: LnXt=LnX0 +mt

Calcolo m Un grafico del logaritmo naturale della biomassa contro il tempo in fase esponenziale dà una linea retta con m come coefficiente angolare. Se uso i log10, il coefficiente angolare è uguale a m/2,303

Numero di cellule Ad ogni divisione, il numero di cellule raddoppia partendo da un inziale N0 Nt=N02n n=(LN(Nt)-LN(N0))/LN(2) td = t/n = t LN(2)/(LN(Nt)-LN(N0)) In crescita exp bilanciata dimensioni medie costanti, relazione tra numero di cellule e biomassa. Considerando che in un td la biomassa passa da x0 a 2x0 2x0=x0emtd ; LN(2x0)=LN(x0) + mtd ; mtd = LN (2) td = LN(2)/m

Velocità e rese Le velocità volumetriche di formazione prodotti e scomparsa substrati sono determinabili sperimentalmente Velocità specifiche (ri)sono ottenute normalizzando le volumetriche per la biomassa presente. Rese: quantità di substrato che viene recuperata in biomassa o prodotti. Definita come rapporto delle velocità specifiche. YSX=m/rs YSP=rp/rs Indicatore ultimo della distribuzione dei flussi metabolici Attenzione al senso (sX). YXS è la quantità di substrato convertito per unità di biomassa formata. RQ è la resa della CO2 sull’O2: rCO2/rO2

BLACK BOX Una singola reazione riassume tutte le reazioni della cellula. Tutte le rese sono quindi costanti La velocità di consumo del substrato è allora rs=YXSm Anche la formazione del prodotto, il consumo di ossigeno, etc, sono proporzionali alla m Come otteniamo l’entrata in stazionaria? Una singola cellula di E. coli che si duplica ogni 20’ in 43 ore occupa il volume della Terra, e in 45 ore ne eguaglia il peso

m in relazione a S m = mmax S/ (Ks + S) Per un substrato limitante, la velocità dipende dalla concentrazione solo entro certi limiti. Un modo popolare per descrivere questo comportamento è il modello di Monod: m = mmax S/ (Ks + S)

Maintenance La resa non è costante al variare delle condizioni di crescita. “Metabolismo endogeno” Pirt: maintenance (ms), la resa può non essere costante rs= YtrueXSm+ms YSX=m/(YtrueXSm+ms) A bassi valori di m la resa in biomassa decresce perché una quota crescente di substrato è utilizzato per le necessità del mantenimento; se m è alta m è trascurabile e si torna alla formula originaria. rATP=YXATP+mATP

Mass Balances d(cs,iV)/dt = -rs,ixV + Fcfs,i-Foutcs,i Combinare il modello cinetico con un modello del bioreattore. Accumulo= velocità di formazione + ingresso – uscita d(cs,iV)/dt = -rs,ixV + Fcfs,i-Foutcs,i F cfi Fout ci x V ci x

d(cs,i)/dt=-rs,ix + D(cfs,i- cs,i) Mass Balances d(cs,iV)/dt=-rs,ixV + Fcfs,i-Foutcs,i Dividendo per V: d(cs,i)/dt=-rs,ix + Fcfs,i/V-Fout cs,i /V D = F/V dilution rate Fed batch: Fout =0 Batch e continuo F=Fout d(cs,i)/dt=-rs,ix + D(cfs,i- cs,i)

Batch dx/dt=mx ; x(t=0)=x0 dcs/dt=-rsx ; cs (t=0) = cs,0 Equazione diff primo ordine, si può calcolare la biomassa nel tempo. La biomassa si accrescerà nel tempo, consumando il substrato, in accordo con Monod, e l’andamento del substrato sarà in accordo con cs=cs,0 – YXS (x-x0) Poiché alla fine il substrato è 0: YSX=(xfinale-x0)/cs,0 Per definizione

Simulazione batch

(Ж) d(cs,i)/dt=-rs,ix + D(cfs,i- cs,i) Chemostato (Ж) d(cs,i)/dt=-rs,ix + D(cfs,i- cs,i) dx/dt=mx-Dx; dx/dt = (m-D)x m=D x = YSX(cfs-cs): è possibile misurare precisamente la resa (la derivata (Ж)=0, YSX=m/rs) cs=DKs/(mmax-D): la concentrazione del substrato limitante aumenta con D Calcolo maintenance: x = D (cfs,i- cs,i)/(YtrueXSD +ms), regressione lineare.

d(cs,iV)/dt=-rs,ixV + Fcfs,i-Foutcs,i Fed batch d(cs,iV)/dt=-rs,ixV + Fcfs,i-Foutcs,i D = dV/Vdt: se voglio mantenerlo costante feeding esponenziale: Fout = 0 quando t=0 d(xV)/dt = m0xV ; xV=x0V0em0t F(t)= YXSm0x0V0em0t/(cfs-cs) m0: la specifica velocità che voglio mantenere

Esempio pratico: produzione di interleukina in Z. bailii Batch reactor Fed-batch reactor Variable Kinetic model Phases kinetic model Biomass mG = mmax G/(G+ksG) 0 = t <t* Fed A mA = costant 0≤ t ≤ tA mE = mmaxE E/(E+ksE) t>t* Fed B mB1 = mA exp [(tA-t)/tX] tA <t ≤ t1 mB2 = mA exp [(tA-t1)/tX] t >t1 Glucose qG = mG/YX/G 0 ≤ t <t* Fed A (qG)A = mA/(YXG)A 0 ≤ t ≤ tA Fed B (qG)B1= mB1/(YXG)B tA <t≤ t1 (qG)B2= mB2/(YXG)B t >t1 (YX/G)B = (YX/G)Aexp(-(t/tG)) EtOH (product) (qE)p = mGYE/X 0 ≤ t < t* — — EtOH (substrate) (qE)S = mE/YX/E t≥ t* — — IL-1b (qIL)G = mGYIL/X 0 ≤ t < t* Fed A (qIL)A = mA(YIL/X)A 0 ≤ t ≤ tA (qIL)E = mEYIL/X t ≥ t* Fed B (qIL)B1=mB1 (YIL/X)B tA <t ≤ t1 (qIL)B2=mB2 (YIL/X)B t >t1 (YIL/X)B = (YIL/X)A exp (-t/tIL)

Esempio pratico: produzione di interleukina in Z. bailii Parameters used for simulations. Parameters Values Determination Batch mmaxG 0.28 h-1 experimental and ref. [15] mmaxE 0.02 h-1 by fitting YX/G 0.18 (g g-1) experimental YX/E 0.10 (g g-1) experimental YIL/X 4.5 x106 (g g-1) experimental YE/X 1.11 (g g-1) experimental kSG 15 (g l1) by fitting kSE 30 (g l1) by fitting Fed-batch (A) (YX/G)A 0.37 (g g-1) experimental (YIL/X)A 1 x 105 (g g -1) experimental Fed-batch (B) tX 8.7 h by fitting tG 102 h by fitting tIL 37.2 h by fitting

Fase batch

Fase fed batch

Dove sta il problema?

Fase fed batch