Esempi di sviluppo e analisi bioprocessi Introduzione

Introduzione Idea innovativa Miglioramento sperimentale Breakpoint Realizzabilità pratica Process simulation Economic analysis Profitability? Yes market; No loop

Piano del corso Sistema sperimentale modello acido lattico Acquisizione dati in laboratorio quaderno di laboratorio Simulazione del processo SuperPro Design Punto di pareggio (Break even) Richiesta finanziamento

Chimica delle fermentazioni data orario aula 4 ottobre 15:30-17:30 U1-04 7 ottobre 11 ottobre 14 ottobre Lab 2026 18 ottobre 21 ottobre 25 ottobre 28 ottobre Chimica delle fermentazioni

Flusso della fermentazione separazione del prodotto, purificazione. componenti non usati e intermedi e by-products: utilizzati in altro modo o smaltiti.

Processo Ambiente Produttività Genotipo Microorganismo Alcoli Acidi organici Polipeptidi Polisaccaridi complessi Lipidi Sostanze Eterogenee lignina residui cellulosici ….. Ambiente Genotipo Produttività

I microorganismi sono responsabili di ogni fermentazione complessi sistemi enzimatici aumento produzione: si ottiene agendo su ambiente nutritivo opportuno sistema di fermentazione

Interazioni ambiente microorganismo controllo ambientale deve essere determinato sperimentalmente shake flasks (nutrienti, temperatura) bioreattori (pH, ossigenazione) controllo genetico

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Utilities SUBSTRATO PRODOTTO Analisi Pretrattamento pH, sali N, P Preparazione medium Acqua Mixing technology Proliferazione production strain Sterilizzazione Energia Inoculo Aria Fermentazione CO2, gas, calore Misura & Controllo Biomassa Separazione biomassa/liquido Filtrazione Brodo residuo Separazione Isolamento prodotto Residui fermentazione Purificazione Formulazione Residui fermentazione PRODOTTO Smaltimento Residui

Richiesta di utilities Mixing (fermentation) Aeration Cooling Product separation Sterilization Stirring, pumping Compression, air separation Water cooling Centrifugation, filtration, chromatography, distillation, drying, extraction, crystallization Steam Chimica delle fermentazioni

Scelta del microorganismo Caratteristiche nutritive (substrati a basso costo) Optimum temperatura (reduce cooling) Caratteristiche morfologiche (interazioni con apparati e processo) Stabilità genetica Produttività Facilità di recovery del prodotto Chimica delle fermentazioni

Chimica delle fermentazioni 27/03/2017 Conservazione ceppo Eliminare variazioni geniche, proteggere dalla contaminazione e mantenere vitalità “Animazione sospesa” Temperatura ridotta Agar slants (5°, -20°C; 6 mes) Azoto liquido (-196°, glicerolo, years) Disidratazione Disidratazione (silica gel, anni) Liofilizzazione (freeze-drying, latte, siero o glutammato, anni) Quality control Quality control Chimica delle fermentazioni

Chimica delle fermentazioni Flusso inoculo MASTER Ceppo originale Working bank Collezione di lavoro Liofilizzato 4-10 dd Inoculo Congelato 6 h-7 dd Refrigerato 5 dd Inoculo Batteri 0.1-3 % Inoculo Funghi 5-10 % Spore 1-5x108 Fermentazione PRODOTTO Chimica delle fermentazioni

Caratteristiche inoculo in attiva crescita buona concentrazione cellulare privo di contaminazioni costante capacità di formare il prodotto Chimica delle fermentazioni

Chimica delle fermentazioni 27/03/2017 Upstream processing Preparazione e immagazinamento substrati e soluzioni: definire volume e composizione, sequenza aggiunte, condizioni Mixing tank (alte conc., separazione C e N)) Modalità conservazione (capital investiment), validated Sterilizzazione (batch, continuo) Filtrazione (gas, termolabili) Calore (steam) 140° 240 sec Chimica delle fermentazioni

Chimica delle fermentazioni Upstream -2 Preparazione inoculo Ogni vial= 1 seed train, fattore 10 (capital investiment) Il medium privilegia velocità di crescita e minimizza produzione CIP Acqua di processo – H3PO4 20% - acqua – NaOH (5M)-acqua Ottimizzare tempistiche e temperature  scheduling e durata processo Chimica delle fermentazioni

Chimica delle fermentazioni Downstream Yield vs purity Dipende da upstream e fermentazione Alte concentrazioni prodotto, basse conc contaminanti C’è sempre perdita, minimizzare gli step Chimica delle fermentazioni

Chimica delle fermentazioni Downstream -2 Chimica delle fermentazioni

Schema downstream (Lisare) Separare Concentrare Purificare Formulare Tecniche tradizionali e specializzate

Lisi cellule Meccanica (bead mills) High pressure 27/03/2017 Lisi cellule Meccanica (bead mills) High pressure Producono misture complesse, aumentano la viscosità, lasciano debris Bead mills: cilindri rotanti con palline di titanio o zirconio che riempiono l’80% del volume. Ruotando, rompono le cellule, con efficienza dipendente dal tipo di cellule. Sviluppa calore. High pressure (french press) fino a 500 atm, non funziona con organismi filamentosi. Buona per lo scale up, preferibile ai mulini. Problema del calore. Sonicazione per cellule batteriche, genera calore

Possibili ulteriori passaggi Protein refolding Post translational processing Chimica delle fermentazioni

Separazione solido-liquido Cellule Debris Proteine precipitate Inclusion bodies

Chimica delle fermentazioni Filtrazione Piastre forate, sabbie, lana di vetro… Chimica delle fermentazioni

Chimica delle fermentazioni Rotary drum Chiarificazione (10-40%) Chimica delle fermentazioni

Centrifugazione in continuo Chimica delle fermentazioni

Chimica delle fermentazioni 27/03/2017 Concentrazione Evaporazione /distillazione Ripartizione liquido-liquido Filtrazione con membrane (Cross flow) Precipitazione proteine ammonio solfato, acetone, etanolo, PEG, pH Adsorbimento (carbone attivo, resine) Cristallizzazione da una soluzione supersatura. Raffreddamento, evaporazione del solvente, evaporazione sottovuoto Drying ad alta temperatura (spray drying) o liofilizzazione (bassa temperatura e sottovuoto) Chimica delle fermentazioni

Ripartizione liquido-liquido Chimica delle fermentazioni

Chimica delle fermentazioni Purificazione Estrazione con fase organica Distillazione Adsorbimento Cromatografia Gel exclusion Affinity Ion-exchange HIC Reverse phase Chimica delle fermentazioni

Chimica delle fermentazioni Formulazione Massima vita del prodotto commerciale Metaboliti bulk: concentrati (rimozione acqua), cristallizzazione Proteine (soluzioni, sospensioni, polveri) aggiunta stabilizzanti (ammonio solfato, sodio cloruro, saccarosio, lattosio, sorbitolo, glicerolo, PEG, BSA) Enzimi bulk: liquidi concentrati Prodotti termolabili: liofilizzazione Chimica delle fermentazioni