Analisi di variabilità genomica: risorse e metodi per l'analisi dei dati m.attimonelli@biologia.uniba.it Dip.Biochimica e Biologia Molecolare 23-marzo-2006

Variabilità è un termine a cui è associata una enormità di problematiche scientifiche e culturali. Variabilità intra-specie Variabilità inter-specie In questa lezione verrà posta l’enfasi sulla variabilità intra-specie umana (human diversity)

Variabilità Umana La variabilità umana rappresenta i “range” di possibili valori associati ad ogni caratteristica misurabile, fisica o mentale, dell’essere umano. Le differenze fra tali valori possono essere irrilevanti o significative, transitorie o permanenti, volontarie o involontarie, congenite o acquisite, genetiche o ambientali. L’insieme di tali differenze rendono ognuno dei 6,5 miliardi di individui che popolano il pianeta terrestre diverso da tutti gli altri.

Variabilità Genetica La variabilità genetica è determinata dalle mutazioni che rendono due individui diversi. Il Genoma Umano nucleare di due individui è conservato per il 99,9%, il rimanente 0,1% racchiude quelle differenze che rendono i due individui diversi. Studiare tali differenze consente di…

…….. comprendere le cause molecolari delle malattie genetiche studiare le origini dell’uomo studiare le migrazioni delle popolazioni attuali

Tali studi sono stati condotti da che si sono scoperte le leggi fondamentali della genetica e quindi dell’ereditarietà ma l’avvento della Genomica ha dato un enorme impulso a tali studi sia per quanto riguarda la quantità di informazioni disponibili che per quanto riguarda l’accuratezza delle stesse che oggi consentono di effettuare le analisi ad un livello molto più puntuale.

La variabilità genetica deriva dall’esistenza delle mutazioni

Variabilità Percentuale di siti che mutano rispetto al totale nel confronto “pairwise” Genoma Umano nucleare: mediamente 0,1%. Genoma Umano mitocondriale: mediamente 0,3%. Variabilità media : n. di siti varianti, rispetto al numero di siti totali costituenti il genoma, osservati in un gruppo di individui Variabilità media nucleare umana: 10MSNPs/3000Msiti*100 = 0,3% (il n. di individui e popolazioni è difficile da stimare) Variabilità media mitocondriale : 3466SNPs/16570siti*100= 21% su 2150 genomi mt umani

Mutazione fattori naturali fattori ambientali Alterazione della sequenza di DNA causata da fattori naturali fattori ambientali

Mutazione Mutazioni di singolo nucleotide, delezioni o inserzioni di corti frammenti nucleotidici causano alterazioni in un singolo gene. Mutazioni di grossi frammenti cromosomiali dovuti a delezioni, inserzioni o inversioni sono dette aberrazioni e coinvolgono più geni e quindi proteine.

fattori naturali (errori durante la replicazione : mismatch) Mutazioni di singolo nucleotide, delezioni o inserzioni di corti frammenti nucleotidici causano alterazioni in un singolo gene. fattori naturali (errori durante la replicazione : mismatch) fattori ambientali (modificazioni chimiche dei nucleotidi) Nel caso dei mismatch il sistema di riparo può riconoscere le mutazioni e correggerle, altrimenti le mutazioni si fissano e vengono trasmesse alle progenie.

Mutazioni di singolo nucleotide e delezioni o inserzioni di corti frammenti nucleotidici causano alterazioni in un singolo gene. Mutazioni missenso o non sinonima (sostituzione di un nucleotide che cambia un aa in un altro) Mutazioni non senso (sostituzione di un nucleotide che cambia un aa in un codone di STOP) Mutazione sinonima (sostituzione di un nucleotide nell’ambito della stessa famiglia di codoni) Mutazioni con slittamento causano l’inserimento o la delezione di piccole stringhe. Può verificarsi in qualsiasi parte del genoma ma sono preferite regioni già ripetute che favoriscono lo scivolamento.

Una mutazione può causare l’acquisto di una nuova funzione (positiva) o la riduzione o perdita di una funzione (negativa). Una mutazione può manifestarsi in modo più o meno forte Una mutazione può manifestarsi subito o con effetto ritardato. Mutazione costitutiva che sopprime la regolazione su un gene o un gruppo di geni Mutazione leaky …. Comunque una mutazione è un cambio del genotipo che produce variabilità influenzando più o meno il fenotipo.

Allele ogni possibile stato associabile ad un locus genico Nel caso del singolo sito di DNA possiamo avere 4 alleli (A,C,G,T) Il numero di alleli possibili in un organismo n-ploide è n Allele ogni possibile stato associabile ad un locus genico

Genotipo set di alleli che un individuo presenta su di un locus genico Nel caso del singolo sito di DNA il numero di genotipi possibili per un organismo n-ploide è dato da 4exp(n). Nel caso dell’uomo potremmo avere 16 genotipi diversi.

Polimorfismo presenza su un locus genomico di due o più alleli RFLP : Restriction Fragment Lenghth Polymorphism Microsatelliti: sequenze ripetute in tandem lunghe fino a 150bp, con una unità di 13 bp STS: sequence tagged sites (sequenza lunga da 200 a 500 kb unica nel genoma) SNP : Single Nucleotide Polymorphism

Polimorfismo Secondo la definizione classica di polimorfismo l’allele più raro dovrebbe avere una frequenza minima pari a 1% L’eterozigosità misura il grado di polimorfismo sulla base delle frequenze dei genotipi.

APLOTIPO insieme di sequenze relative ad una definita regione genomica riportanti un set di polimorfismi completamente coincidenti rispetto ad un riferimento Riferimento ATGACAGTG Campione # 1 AACTGATTA Campione # 2 AACTGATTA Campione # 3 AACTGATTA Aplotipo A Campione # 4 AACTGATTA

APLOGRUPPO insieme di APLOTIPI accomunati da un set di siti polimorfici portanti lo stesso allele ereditati dal loro comune ancestore Aplotipo A AACTGATTA Aplotipo B ACCTGTATG Aplotipo C ATCTGATTA Aplotipo D ACCTGGTTT Aplotipo E TACTGATTA 123456789 I siti marcati con i numeri gialli definiscono l’aplogruppo

tag SNPs e Aplotipi Sono stati mappati 10M SNPs nelle popolazioni umane. Alleli di SNPs associati definiscono l’aplotipo Gran parte delle regioni cromosomiche sono caratterizzate da aplotipi molto rari (frequenza max 5%). Tali regioni contengono diversi SNPs ma quelli che definiscono l’unicità dell’aplotipo sono chiamati tag SNPs

Variabilità Genetica Si ricordano le differenze fra erditarietà genetica mendeliana (genoma nucleare) ereditarietà genetica citoplasmatica (genoma mitocondriale) Nell’ambito del genoma nucleare un ruolo particolare ha il cromosoma Y. Ricordiamo infatti che…

cromosomi differenti segregano indipendentemente durante la meiosi …nel genoma nucleare cromosomi differenti segregano indipendentemente durante la meiosi tratti fenotipici (normale o mutante) controllati da geni localizzati su cromosomi differenti segregano indipendentemente tratti fenotipici controllati da geni che segregano insieme con frequenze più alte dell’atteso sono associati (linked) a causa della ricombinazione non è detto che geni localizzati sullo stesso cromosoma siano associati l’analisi di linkage fornisce una misura della probabilità che due loci siano associati. il cromosoma Y è presente solo nei maschi e quindi viene ereditato solo per via patrilineare, inoltre il cromosoma Y ha una regione estesa che non ricombina

…nel genoma mitocondriale l’eredità è citoplasmatica e materna: il mitocondrio si duplica in interfase nel citoplasma (eredità citoplasmatica) e durante la meiosi è l’uovo che trasferisce il citoplasma allo zigote (eredità materna) il genoma mitocondriale non ricombina il mitocondrio è presente in copie multiple nel citoplasma e ogni mitocondrio possiede più copie del genoma (all’incirca 10 nell’uomo) se il genoma mitocondriale subisce delle mutazioni  eteroplasmia (% di molecole mutate rispetto al “wild-type” ) la segregazione delle molecole mutate rispetto al wild type è random o dipende da fattori specifici? (Chinnery et al., Trends in Genetics Volume 16, Issue 11 , 1 November 2000, Pages 500-505)

Variabilità Genetica L’avvento delle tecniche di sequenziamento prima e della Genomica poi hanno dato un impulso sempre più crescente agli studi di genetica di popolazione e alla comprensione dei meccanismi molecolari associati alle malattie genetiche. L’oggetto di osservazione su cui ci si è concentrati ha dimensioni differenti nel caso del genoma nucleare rispetto al genoma mitocondriale. Genoma nucleare  SNPs Genoma mitocondriale  la sequenza dell’intero genoma

Genomica Mitocondriale

12s rRNA Cyt b 16s rRNA ND5 ND1 ND2 ND4 ND4L ND3 COI COIII ATPase6 OH PH F T Cyt b V 16s rRNA 0 / 16569 P PL E ND6 DEAF 1555G LHON 14484C L MELAS 3243G LHON 14459A ND5 ND1 LHON 3460A I Q L M S H LHON 11778A ND2 A N ND4 OL C W Y NARP 8993 G/C MERRF 8344G ND4L R S ND3 G COI COIII 5 kb deletion KSS D ATPase6 The Human Mitochondrial DNA Map From MITOMAP http://www.gen.emory.edu/mitomap.html COII K ATPase8 Complex III genes (ubiquinol: cytochrome c oxidoreductase) Complex I genes (NADH dehydrogenase) Transfer RNA genes Complex IV genes (cytochrome c oxidase) Complex V genes (ATP synthase) Ribosomal RNA genes

Schematica rappresentazione della regione D-loop nei mammiferi CSB domain Central conserved ETAS domain domain H strand C HSP C C C 5' O H 3' 3 2 1 2 1 CSBs ETASs mtRNAprocessing Pro Phe HVS 2 HVS 1 tRNA tRNA 5' mrp 3' RNA DNA mtRNApol+mtTFA L strand LSP

Genoma mitocondriale Per le caratteristiche precedentemente descritte del mitocondrio, gli studi di genetica popolazione si sono fortemente concentrati sul mitocondrio. Prima dell’avvento della genomica, i genetisti popolazionali hanno utilizzato come marcatori le sequenze delle regioni HVS1 e HVS2 del D-loop e i polimorfismi RFLP della regione codificante. La regione HVS1 è stata sequenziata in un elevatissimo numero di popolazioni (in GenBank sono annotate circa 11000 sequenze relative al D-loop o a sue parti). Ciò ha permesso la individuazione, su un elevatissimo numero di popolazioni mondiali, degli aplotipi e quindi degli aplogruppi mitocondriali. Analogamente è stato condotto uno screening a largo raggio della regione codificante attraverso gli RFLP. Gli studi più recenti sul D-loop ….

Group II Group I Group III

Genoma mitocondriale Il sequenziamento dei genomi mitocondriali completi ha consentito una classificazione più fine degli aplogruppi. 2150 genomi disponibili relativi ai 5 continenti. La classificazione degli aplogruppi

La risorsa genomica mitocondriale HmtDB

HmtDB Variabilità sito specifica e classificazione degli aplogruppi Siti del mtDNA con valori di variabilità discriminanti in una particolare area geografica, rispetto al resto del mondo, fungono da marcatori molecolari di aplogruppi localizzati nella specifica area.

L’algoritmo MSD per il riconoscimento dei siti marcatori I dati ottenuti da Site_Var sono quindi analizzati con uno script che calcola il parametro MSD (Mean Simple Deviation) al fine di quantificare i “valori di variabilità discriminanti” Siti con MSD maggiori di una prefissata soglia sono con molta probabilità marcatori di aplogruppi. Abbiamo così individuato 81 siti caratterizzanti nuovi sottoaplogruppi

12s rRNA Cyt b 16s rRNA ND5 ND1 ND2 ND4 ND4L ND3 COI COIII ATPase6 OH PH F T Cyt b V 16s rRNA 0 / 16569 P PL E ND6 DEAF 1555G LHON 14484C L MELAS 3243G LHON 14459A ND5 ND1 LHON 3460A I Q L M S H LHON 11778A ND2 A N ND4 OL C W Y NARP 8993 G/C MERRF 8344G ND4L R S ND3 G COI COIII 5 kb deletion KSS D ATPase6 The Human Mitochondrial DNA Map From MITOMAP http://www.gen.emory.edu/mitomap.html COII K ATPase8 Complex III genes (ubiquinol: cytochrome c oxidoreductase) Complex I genes (NADH dehydrogenase) Transfer RNA genes Complex IV genes (cytochrome c oxidase) Complex V genes (ATP synthase) Ribosomal RNA genes

Le mutazioni mitocondriali patologiche MITOMAP

Leberhaplogroup

Febbraio 2001 : pubblicazione del Genoma Umano Consorzio pubblico Celera Genomics

I grandi progetti Antropo-molecolari Il progetto Genoma Umano ha posto le basi e ha creato le premesse per lo studio sistematico della variabilità umana Human Diversity (pre Genoma) HapMap National Geographic

Human Genome Diversity Project HGDP Progetto lanciato agli inzi degli anni 90 con l’obiettivo di raccogliere in maniera sistematica e su larga scala campioni biologici relativi a popolazioni rappresentative di tutto il globo terrestre per la comprensione dei meccanismi che hanno generato e genereranno in futuro la variabilità umana per scopi culturali ma anche e soprattutto di interesse biomedico. Il lancio di tale progetto ha provocato numerosi dibattiti per le problematiche etiche connesse soprattutto in relazione al campionamento di popolazioni indigene per le quali si temeva un utilizzo commerciale dei campioni. Nature Reviews Genetics 6, 333-340 (2005); doi:10.1038/nrg1596   THE HUMAN GENOME DIVERSITY PROJECT: PAST, PRESENT AND FUTURE L. Luca Cavalli-Sforza    

Human Genome Diversity Project HGDP Superati i problemi etici sono state raccolte per le popolazioni indigene linee cellulari di linfoblastomi Il lancio vero e proprio del progetto nel 2002. Il CEPH raccoglie i campioni Nature Reviews Genetics 6, 333-340 (2005); doi:10.1038/nrg1596   THE HUMAN GENOME DIVERSITY PROJECT: PAST, PRESENT AND FUTURE L. Luca Cavalli-Sforza    

52 popolazioni raccolte nel progetto HGDP

HGDP primi risultati 377 polimorfismi di microsatelliti relativi a 1056 individui di 52 popolazioni

I grandi progetti Antropo-molecolari Il progetto Genoma Umano ha posto le basi e ha creato le premesse per lo studio sistematico della variabilità umana Human Diversity (pre Genoma) HapMap National Geographic

HapMap Project Finalità : catalogare e rendere pubblicamente disponibili aplotipi del genoma umano relativi a specifiche regioni del cromosoma per effettuare studi di associazione finalizzati al riconoscimento di geni associati a malattie o il loro ruolo nella risposta al farmaco. Partecipanti Popolazioni : 4 popolazioni per un totale di 270 campioni Pubblicazioni Accesso ai dati : Mart Browser    

I grandi progetti Antropo-molecolari Il progetto Genoma Umano ha posto le basi e ha creato le premesse per lo studio sistematico della variabilità umana Human Diversity (pre Genoma) HapMap National Geographic

Progetto lanciato dalla NG society e supportato dall’IBM e dalla Waitt Family Foundation Raccoglierà campioni relativi a 1000 popolazioni indigene per approfondire le conoscenze sulla diffusione dell’uomo nella preistoria

Le risorse Bioinformatiche per la Human Diversity dbSNP : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/ deCODE : http://www.decode.com/ EMPOP : http://www.empop.org/ Ensembl : http://www.ensembl.org HapMap http://www.hapmap.org HmtDB : http://www.hmdb.uniba.it Human Diversity : http://www.stanford.edu/group/morrinst/hgdp.html MitoMAP: http://www.mitomap.org mtDB : http://www.genpat.uu.se/mtDB/ mtSNP : http://www.giib.or.jp/mtsnp/search_home_e.html OMIM : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/OMM UCSC : http://genome.ucsc.edu/

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