Il piano nazionale e regionale di selezione genetica per la resistenza alle TSE ovine Marco Tamba Centro Emiliano-Romagnolo di Epidemiologia Veterinaria Ferrara, 11/11/05

Scopo della presentazione Conoscere la “filosofia” del piano di selezione genetica per la resistenza alle TSE Presentare il piano regionale (Del. 1356/04 del 12/07/04) Presentare il piano nazionale (DM 17/12/2004)

Focolai di scrapie in Italia: curva epidemica 1995-2005 211 focolai 2 in corso di conferma >87.000 animali coinvolti

Focolai di Scrapie denunciati in Emilia-Romagna (dati al 31/10/05) Dal 1991 ad oggi in Emilia-Romagna sono stati denunciati complessivamente 12 focolai di Scrapie. 6/9 province hanno registrato almeno un focolaio.

Distribuzione geografica: (1995-2005) Incidenza di allevamenti colpiti Ovini: 8,1 milioni* Caprini: 978 mila* *Dati Eurostat dicembre 2004

Obiettivi del piano Obiettivo generale del Piano è quello di in-crementare la frequenza dei caratteri di resistenza genetica alle TSE nella popolazio-ne ovina al fine di: a) contribuire alla tutela della salute umana ed animale; b) concorrere al controllo delle TSE degli ovini; c) concorrere alla creazione di aziende ovine a “basso rischio” di TSE.

Obiettivi del piano Obiettivi specifici del piano sono: a) eliminazione dell’allele VRQ dagli allevamenti aderenti al piano; b) incremento della frequenza dell’allele ARR negli allevamenti aderenti al Piano. c) aumento della disponibilità di montoni con genotipo resistente (ARR/ARR), utili anche per il ripopolamento degli allevamenti infetti; d) progressiva diminuzione della frequenza dell’allele ARQ negli allevamenti aderenti al piano.

Basi del piano Il piano si basa sull’osservazione del fatto che solamente determinati genotipi ovini sembrano ammalarsi di scrapie. Malattia # Infezione

La Scienza dietro la Genetica della Scrapie ci dice: Alcune pecore si ammalano più facilmente di altre La Genotipizzazione è usata per identificare i geni che controllano la suscettibilità o la resistenza alla scrapie ? ?

La Scrapie e i montoni… I montoni prendono la scrapie I montoni infetti non sembrano in grado di trasmettere la scrapie La genetica del montone influenza la suscettibilità alla scrapie dei propri figli Semen and seminal fluids are not known to “carry” scrapie. New studies are warranted as new technologies for detecting the scrapie agent (PrPsc) are developed.

e le Capre? Ad oggi non sono stati identificati genotipi resistenti nelle capre. Pertanto, tutte le capre devono essere considerate suscettibili alla Scrapie. As scientific information is incomplete, all goats on scrapie infected farms are depopulated.

Cos’è la Genotipizzazione? La Genotipizzazione è un test del DNA Un semplice esame del sangue o di tessuti permette di determinare il genotipo degli ovini il genotipo non cambia mai. Un solo esame basta per tutta la vita. Può essere definito a qualsiasi età For the benefit of this presentation genotyping is defined as DNA testing. DNA/Genotyping of an individual sheep does not change over time. The genotype (genetic foundation/DNA) the sheep is born with will always be the same.

Genotipizzazione E’ preferibile usare un sistema di identificazione permanente (microchip o 2 marche) sui capi da esaminare Il prelievo deve essere eseguito sotto il controllo di un veterinario riconosciuto Usare provette con EDTA e farle arrivare al Laboratorio prima possibile (o congelate) Il Genotipo rimane lo stesso per tutta la vita dell’animale It is advisable to use duplicate ear tags in case the sheep loses one ear tag prior to receiving genotyping results. Test results are less like to be questioned by recipients if the blood is drawn and submitted by an objective third party. The blood needs to be drawn into purple top tubes. Immediately after the blood is drawn the tubes need to be gently rocked back and forth 3 times to prevent the blood from coagulating. Then the tubes need to be placed in a cooler and transferred to a refrigerator. The blood should be shipped in a cooler with ice packs or ice. The lab should receive the sample within 48-72 hours of sample collection. Practically speaking, the blood should be drawn on a Sunday or Monday and shipped by Tuesday via 2nd-day or next day delivery.

Genotipizzazione Una genotipizzazione viene riconosciuta ufficialmente se: il sangue è prelevato da un veterinario AUSL o riconosciuto Il capo è identificato ufficialmente Il campione è inviato al lab accompagnato dall’allegato IV del DM 17/12/2004 Il lab è stato riconosciuto dal Min.Salute

Laboratori che effettuano le genotipizzazioni Laboratorio Gruppi sanguigni di Cremona solo per allevamenti iscritti a libro genealogico IZSLER - Sezione di Modena Ovini della Regione Emilia-Romagna Please read and follow each lab’s sampling and handling instructions Handling the sample, in general: The blood needs to be drawn into purple top tubes. Immediately after the blood is drawn the tubes need to be gently rocked back and forth 3 times to prevent the blood from coagulating. Then the tubes need to be placed in a cooler and transferred to a refrigerator. The blood should be shipped in a cooler with ice packs or ice. The lab should receive the sample within 48-72 hours of sample collection. Practically speaking, the blood should be drawn on a Sunday or Monday and shipped by Tuesday via 2nd-day or next day delivery.

Cos’è la Genotipizzazione? (cont.) Può capitare che un ovino già genotipizzato debba essere ricampionato: Problemi di identificazione dell’animale o del campione Campione non idoneo per l’esame (degradato) Errori nell’identificazione dell’animale Verifica sul genotipo effettuata per sorveglianza da parte della A.USL Il test del genotipo misura solo la suscettibilità e non se l’animale ha la scrapie Why two blood tests? – human error could be mislabeling tube at farm, in lab, quality control in lab, or quality of sample submitted. The two samples are taken at 2 different times – not in the same visit and sent to 2 different labs. If the results are different a third test is completed. Genotype testing is NOT testing for SCRAPIE infection only for genetic susceptibility. Later in the presentation what genotype of exposed sheep can be sold will be indicated.

Genotipo sensibile # Animale infetto Basi del piano La tipizzazione genetica rileva solamente il grado di suscettibilità del soggetto esaminato alla malattia clinica. Genotipo sensibile # Animale infetto

Dettagli di Genetica Gli ovini hanno un paio di geni che influenzano la suscettibilità alla scrapie Questi geni sono conosciuti come geni PRNP (PrioN Protein) Ogni ovino ha due copie (un paio) di geni PRNP — Una copia da ciascun genitore This slide might be one that is difficult to explain. The intent is to explain that there is only one pair of genes (two copies) that affect scrapie susceptibility. The slide then explains, genetically, the basis of how each sheep receives that gene with one copy coming from each parent.

Dettagli di Genetica (cont.) Negli ovini, il gene PRNP produce una proteina prionica normale PrPc Negli ovini infetti da scrapie la PrPc viene modificata in: PrPsc, proteina prionica scrapie, la forma patologica e infettiva della proteina prionica Normal prion protein is all folded the same way. The abnormal prion protein molecule is misfolded from the normal protein. The abnormal prion protein makes more abnormal prion protein by causing the normal prion proteins to be misfolded.

La teoria del prione La PrPc esiste in tutti gli animali con piccole differenze di specie PrPsc produce più copie di sé stessa, provocando una modificazione strutturale della proteina prionica normale. Normal prion protein is species dependent. Amino acids are building blocks of proteins. The DNA is the “engineer”. The codon is the “construction manager”. The cell is the “laborer” and the amino acids are the “building blocks”. The prion is a functional finished product. If the finished product is not constructed correctly it will not work the way the engineer intended. The PrPsc is what causes subsequent lesions in the brain.

Dettagli sul Gene PRNP Tutti i geni, PRNP compreso, sono composti da codoni Ciascun codone dice alla cellula di mettere uno specifico aminoacido in un punto particolare di una proteina che sta costruendo La proteina prionica PrPc (prodotta dal gene PRNP) ha 254 aminoacidi I punti dei 254 aminoacidi sono numerati da 1 a 254 The following information is intended to be helpful to the presenter in understanding, if needed, the above slide. It was not intended for the audience. Codons are composed of 3 bases, that in combination instructs the cell which specific amino acid is placed in each particular position. The combination of amino acids creates the specific protein. The PrPc protein in sheep is composed of 254 amino acids. For a more detailed discussion please refer to the USDA, APHIS, VS scrapie website: http://www.aphis.usda.gov/vs/nahps/scrapie/ click on Genetic Resistance to Scrapie to read the paper entitled “The Genetics of Scrapie Susceptibility”.

Geni e Scrapie Nel gene PRNP, tre codoni influenzano la suscettibilità alla scrapie Codone 171 Codone 154 Codone 136 Codone 141 (141F correlata a infezione con ceppo atipico Nor98) While there are 254 codons that build the PRNP gene, only three of these codons are known to affect the scrapie susceptibility. Susceptibility to different strains of scrapie is determined in part by different codons. In the U.S. susceptibility to most strains is determined by codon 171. In the U.K. susceptibility is determined primarily by codon 136.

Genetica & Suscettibilità alla Scrapie Codone 136 - Influenza la suscettibilità negli ovini esposti ad alcuni ceppi di scrapie Codone 154 - Gioca un ruolo minore Codone 171 - E’ il maggiore determinante della suscettibilità alla scrapie The codon we will concentrate on is 171 since this codon is the primary determinant of susceptibility in U.S. sheep. There have been 3 cases in U.S. flocks where codon 136 has been important in determining susceptibility in those sheep. Codon 154 only provides partial resistance to scrapie and is therefore not used in U.S. regulatory programs.

Codoni 136 & 171 e i loro polimorfismi Il Codone 136 codifica per l’aminoacido Valina (V), Alanina (A) o Treonina (T) Il Codone 171 codifica per l’aminoacido Glutamina (Q), Arginina (R), Istidina (H), o Lisina (K): Si considera che Q, H, K al 171 abbiano la stessa suscettibilità e vengono refertati come Q dalla maggior parte dei laboratori For the remainder of the presentation sheep that have K or H at codon 171 will be considered the same as sheep that are Q at 171. So, when Q is used it will represent sheep that are Q, K or H at codon 171.

Come si scrivono i Genotipi I genotipi ovini possono essere scritti in due modi: Lettere degli aminoacidi: ARQ/ARR, ARR/VRQ, etc. (l’ordine delle lettere è quello numerico dei codon 136, 154 e 171), oppure Il numero del Codone seguito dall’ amino acido corrispondente: 171QR, 171RR, etc.

Geni Ovini: Uno da ciascun genitore Ogni genitore dà una copia del gene all’agnello. Il gene è in genere uno di questi tre: ARQ (wt), VRQ, ARR, Quindi, ogni agnello porta due copie del gene. Le combinazioni possibili sono: ARQ/ARQ, ARR/ARQ, ARR/ARR, ARQ/VRQ, ARR/VRQ, VRQ/VRQ. I genotipi rari AHQ, ARH, ARK, TRQ, ecc. sono considerati equivalenti all’ARQ. If both parents contribute an AQ gene then the lamb will be AA QQ. If one parent contributes an AR gene and the other contributes an AQ gene then the lamb will be AA QR. If both parents contribute an AR gene then the lamb will be AA RR If one parent contributes an AQ gene and the other contributes a VQ gene then the lamb will be AV QQ If one parent contributes an AR gene and the other contributes a VQ gene then the lamb will be AV QR If both parents contribute a VQ gene then the lamb will be VV QQ. The VR gene combination has not been observed in nature. For a more detailed discussion please refer to the USDA, APHIS, VS scrapie website: http://www.aphis.usda.gov/vs/nahps/scrapie/ click on Genetic Resistance to Scrapie to read the paper entitled “The Genetics of Scrapie Susceptibility”.

Combinazioni dei genotipi e suscettibilità alla scrapie ARR/ARR - sono resistenti (Classe I) ARR/ARQ - sono semi-resistenti (Classe II) ARQ/ARQ - sono suscettibili (Classe III) ARQ/VRQ - sono molto suscettibili (divieto di impiego come riproduttori) VRQ/VRQ - sono molto suscettibili (divieto di impiego come riproduttori) ARR/VRQ - sono poco suscettibili (divieto di impiego come riproduttori) In anticipation of producers questions, “much less susceptible” is further explained as follows. A few cases of scrapie have been found in U.S. sheep with the AVQR genotype. These cases are thought to be infected with a strain of scrapie susceptibility determined by codon 136. This recent finding is UNLIKE the vast majority of U.S. scrapie cases which are determined by codon 171.

Schema di selezione Classificazione dei riproduttori La selezione avviene per linea maschile; per accelerare la selezione possono essere testate anche le femmine (gruppi di monta).

La ricerca ha dimostrato che: la Scrapie si diffonde alle pecore suscettibili (171QQ) e alle capre attraverso il contatto con la placenta ed i liquidi fetali infetti. Tutte le placente 171QR di pecore infette 171QQ esami-nate sono risultate negative per scrapie, mentre le placente 171QQ di pecore infette 171QQ sono risultate positive. Pertanto, le placente ed i liquidi fetali 171QR di pecore infette non dovrebbero essere in grado di trasmettere la scrapie alle altre pecore suscettibili. ? ?

Gli agnelli hanno una combinazione del DNA della pecora e del montone; L’importanza del genotipo della placenta nella trasmissione della scrapie Gli agnelli hanno una combinazione del DNA della pecora e del montone; una pecora 171QQ accoppiata ad un montone 171RR produrrà un agnello 171QR con fluidi e placenta 171QR. una pecora 171QQ accoppiata ad un montone 171QQ produrrà un agnello 171QQ con fluidi e placenta 171QQ. This will become relevant with the following slide. This is background information for the next slide.

Come l’allevatore può usare la Geno-tipizzazione per prevenire la Scrapie Selezionando montoni resistenti (171RR / I Classe) o semi-resistenti (171QR / II Classe) Ogni individuo riceve un gene da ciascun genitore. Montoni resistenti produrranno solamente agnelli resistenti (171RR) o semi-resistenti (171QR). Montoni semi-resistenti (171QR) produrranno agnelli resistenti, semi-resistenti o suscettibili a seconda del genotipo della pecora coperta. This section has a dark green background and is for producers who do not have a known scrapie infection and would like to use genetics to increase resistance in their flock. It is not our goal to rid flocks of all QQ sheep. QQ sheep may have other specific traits that the producer would like to continue. This slide and the following slide are self-explanatory. They compare the outcomes of using genotyped rams versus ewes.

Tabella di suscettibilità degli agnelli

Schema di selezione Utilizzo dei riproduttori La Regione, su parere della Commissione, definisce se una razza ha frequenza di ARR superiore al 40%. Montoni di 3° classe: introdotti solo nei primi 5 anni del piano utilizzabili solo nei primi 7 anni del piano

Come l’allevatore può usare la Geno-tipizzazione per prevenire la Scrapie (cont.) Selezionando pecore resistenti (171RR / I Classe) o semi-resistenti (171QR / II Classe) Una pecora trasmetterà i suoi caratteri di resistenza/suscettibilità allo stesso modo del montone, ma solamente al suo agnello. La genotipizzazione delle pecore ha un basso costo/efficacia rispetto a quella del montone. In pratica è utile solo per le madri di montoni o quando si vuole accelerare al massimo la selezione (allevamento a rischio; razze a bassa frequenza allele ARR). This slide should be preceded by the ram genotype slide. Using genotype testing in a ram is more cost-effective because of the large number of lambs that are affected. Refer to slide 5 regarding the interaction between susceptible genetics and transmission.

Come l’allevatore può usare la Geno-tipizzazione per prevenire la Scrapie (cont.) La Genotipizzazione deve essere considerata come “uno” strumento non come “unico” strumento di prevenzione Il metodo più efficace per evitare l’introduzione della scrapie è quello di non comprare pecore Se il sistema di allevamento richiede l’acquisto di pecore, comprare pecore resistenti (classe I - ARR/ARR) o semi-resistenti (classe II - ARR/***). If maintaining a closed flock is not practical or has not been done because of flock management style: Reduce the risk of introducing scrapie by purchasing ewes only from fully monitored flocks in the Scrapie Flock Certification program: or by the addition of only 171QR and 171RR ewes(resistant genotypes); or Reduce the risk of transmission from undiagnosed ewes in your flock by using 171 RR rams.

Possibili conseguenze della selezione genetica Selezione di portatori sani Comparsa di nuovi ceppi Selezione di animali sensibili all’agente della BSE Selezione di animali maggiormente suscettibili ad altre patologie Effetti negativi sulle produzioni

Chi va piano ... Dal 01/04/05 il piano è obbligatorio per gli allevamenti iscritti ai Libri genealogici e per i greggi ad alto merito genetico. Tutti gli altri allevamenti ovini possono aderire volontariamente.

Chi va piano ... Piani alternativi sulla base della situazione epidemiologica e delle frequenze alleliche; istituzione di una Commissione di coordinamento.

Compiti della Commissione La Commissione deve coordinare le attività: 1. di informazione agli allevatori, e di formazione dei veterinari ufficiali e riconosciuti; 2. di identificazione permanente e tipizzazione genetica nelle aziende aderenti al piano; 3. di selezione genetica negli allevamenti aderenti al piano;

Compiti della Commissione La Commissione deve coordinare le attività: 4. valutare l'andamento del piano e del suo impatto sulla zootecnia (relaz.annuale); 5. Revisionare il piano e, in base alle valutazioni di cui al punto precedente, all’evoluzione della normativa, delle conoscenze scientifiche sulla malattia e della situazione epidemiologica, proporre eventuali modifiche;

Compiti della Commissione La Commissione deve coordinare le attività: 6. rapportarsi con la commissione nazionale di coordinamento e con i diversi enti coinvolti nel piano nazionale; 7. decidere, dietro proposta del servizio veterinario dell’AUSL competente, se un’azienda aderente al piano debba essere esclusa dallo stesso per inadempienza agli obblighi previsti.

Compiti dell’allevatore Allevare e gestire i gruppi di monta Identificare (ID permanente) tutti i riproduttori ovini e caprini di età >6 mesi Segnalare alla AUSL i capi con sintomi sospetti e i morti Segnalare alla AUSL le introduzioni Introdurre ed utilizzare solamente montoni di genotipi ammessi dal piano

Compiti dell’allevatore Macellare/castrare i riproduttori dichiarati non idonei nei tempi [30 gg.](indennizzo) Pulizia, disinfezione e raccolta delle placente Mantenere aggiornato il registro di stalla Aiutare il Servizio Veterinario A.USL nelle operazioni di verifica del piano Eseguire test del DNA aggiuntivi

Compiti della AUSL Identificare gli allevamenti aderenti al piano, raccogliere le domande. Effettuare i prelievi per la tipizzazione genetica dei montoni (veterinario riconosciuto). Assegnare le qualifiche sanitarie agli allevamenti aderenti al piano. Eseguire ispezioni semestrali per la verifica dell’ andamento del piano. Controlli a campione annuali. Predisporre le pratiche per l’indennizzo dei riproduttori non idonei macellati

Schema di selezione Qualifica degli allevamenti La AUSL sulla base della situazione genetica rilevata e sugli esiti delle ispezioni periodiche assegna una qualifica “di resistenza” all’allevamento.

Costi del piano Il SSN copre le spese relative alle analisi genetiche effettuate nelle aziende aderenti al piano. Il SSN indennizza (L.218/1988) i riproduttori (portatori dell’allele VRQ) delle aziende aderenti al piano macellati ai sensi del piano nazionale (DM 17/12/04).

Sistema informativo Presso il CEA è istituita la BDNSG; Presso il CEREV è istituita la BD regionale: allevamenti aderenti (copia allegato 2) qualifiche resistenza (elenco al 31 dic.) ovini tipizzati (da laboratori) ...

Genotipi presenti in Emilia-Rom. Periodo gen.2004-feb.2005 Nell’ambito di un progetto di ricerca sono stati tipizzati geneticamente oltre 1.000 ovini della Regione. I soggetti tipizzati appartenevano a 13 razze diverse. Sono stati rilevati 17 genotipi diversi, alcuni dei quali neppure previsti dal piano nazionale (ARK/***).

Genotipi presenti in Emilia-Rom. Periodo gen.2004-feb.2005 Frequenze alleliche rilevate per le razze dell’ER

Risultati (dati al 4/11/05) 61 domande di adesione pervenute; 700 ovini di 64 aziende tipizzati nell’anno corrente. Frequenze alleliche in Emilia-Romagna nel 2005 Riproduttori classificati in Emilia-Romagna

Punti critici La formazione e l’informazione di allevatori e veterinari; La motivazione e la collaborazione degli allevatori e delle loro Associazioni; L’identificazione degli animali; Il ruolo del veterinario aziendale.

Conclusioni 1 La scrapie è una malattia trasmissibile fortemente influenzata dalla genetica; I genotipi che controllano la suscettibilità e la resistenza alla malattia sono LA cosa più importante da sapere sul controllo con la genetica della scrapie

Conclusioni 2 Alla tipizzazione genetica non consegue una diagnosi di scrapie; Il successo del piano deriverà dal numero di adesioni da parte di allevatori motivati; Risultati apprezzabili in tempi medio-lunghi (5-7 anni).