Claudio Lubello Corso Ingegneria Sanitaria Introduzione ai trattamenti biologici: Cenni di microbiologia e cinetica biologica Claudio Lubello Corso Ingegneria Sanitaria Come abbiamo già descritto introducendo gli ecosistemi un ruolo fondamentale è svolto dai microconsumatori, organismi demolitori che hanno il compito di trasformare composti complessi in elementi semplici riutilizzabili. Questa naturale funzione svolta negli ecosistemi può essere sfruttata all’interno di impianti di trattamento al fine di accelerare la depurazione di sistemi (liquidi o solidi) inquinanti. Per questa ragione in questa lezione introdurremo alcuni concetti generali di microbiologica e di cinetica biologica, che ci serviranno da base per lo studio dei processi di trattamento. 27/03/2017

I microrganismi 27/03/2017

La suddivisione degli esseri viventi: classificazione filogenetica MACRORGANISMI Un tempo, agli albori della sistematica naturalistica, i viventi erano divisi nei due soli regni vegetale e animale. Per il naturalista Linneo (XVIII secolo), gli animali si distinguevano dalle piante perché, a differenza di queste, sono esseri viventi dotati di sensibilità. La scoperta dei microrganismi rese non più soddisfacente tale classificazione. La scoperta e l’accumulo di conoscenze sui batteri ha inoltre portato a riconoscere una prima fondamentale divisione tra i viventi in procarioti e eucarioti, di livello molto superiore a quella tra gruppi diversi di eucarioti come gli animali e le piante. Oggi procarioti ed eucarioti vengono per lo più considerati due super-regni (o dominii) distinti. Anzi, secondo molti sistematici, la grande varietà presente all’interno dei procarioti suggerirebbe di suddividere i viventi addirittura in tre dominii, due dei quali corrispondono agli attuali procarioti: Bacteria e Archaea. Pertanto, anche sulla base delle recenti scoperte sul sequenziamento molecolare dell’RNA ha condotto la suddivisione degli esseri viventi sulla terra in tre domini, rappresentati nella figura: BACTERIA, ARCHAEA, EUKARYA. Albero filogenetico della vita come definito dalla comparazione dell’RNA ribosomale. L’albero è costituito da tre domini degli organismi: Bacteria ed Archaea che hanno una cellula di tipo procariotico ed Eukarya, di tipo eucariotico. In rosso sono cerchiati i macrorganismi tutti gli altri sono quelli comunemente indicati come MICRORGANISMI. 27/03/2017

Procarioti ed Eucarioti La scoperta di microrganismi, cioè creature invisibili ad occhio nudo, è legata all’invenzione del microscopio che permise alla fine del ‘600 di individuare e descrivere, attraverso osservazioni pioneristiche, le prime forme viventi microbiche. Tuttavia è solamente nel XiX secolo con l’avvento di più accurati microscopi che si può individuare la vera nascita della microbiologia per gli studi del botanico tedesco Ferdinand Cohn (1828-1898). Un forte impulso allo studio della microbiologia fu sicuramente l’individuazione di una correlazione fra la presenza di microrganismi e lo sviluppo di malattie. Già dal secolo XVI si pensava che qualcosa fosse responsabile delle malattie contagiose (il cosiddetto contagium) e dopo la scoperta dei microrganismi si riteneva che essi nel fossero la causa. Tuttavia dopo alcune prove indirette, fu solo attraverso gli studi di Koch (1843-1910) che si giunse alla dimostrazione di tale intuizione. In questo stesso settore importanti furono i contributi di Pasteur (1822-1895) che demolì, inoltre, la teoria della generazione spontanea secondo la quale i microrganismi si potevano generare spontaneamente da materiale non vivente. Una classificazione dei microrganismi frequentemente utilizzata fa riferimento ad una suddivisione in procarioti ed eucariori; Procariote: cellula con il nucleo non separato dal resto dell’organismo da una membrana ed in cui non sono presenti organelli; Eucariote: cellula con nucleo delimitato da una membrana e, in genere, con altri organelli. Si noti che tutti i microrganismi eucarioti rientrano nel più ampio dominio degli EUKARYA, di cui fanno anche parte gli animali e le piante.   Eucariote: organismo costituito da cellule con nucleo ben differenziato e separato dal citoplasma per mezzo di una membrana nucleare. Procariote: organismo unicellulare il cui materiale cellulare non è racchiuso dentro una specifica membrana. Manca la suddivisione della funzione cellulare in specifici organuli. 27/03/2017

Batteri I batteri sono organismi procarioti costituiti da una singola cellula. Le cellule batteriche si riproducono per scissione binaria. I batteri possono essere di differente forma: - SFERICA (Cocchi), a BASTONCINO (Bacilli), ELICOIDALE (Spirilli).   In genere le cellule batteriche sono lunghe da 1 a 10 micrometri (10-3mm) e hanno sviluppato gli adattamenti più svariati per ottenere energia e sostanze nutritive. Si trovano in quasi tutti gli ambienti: nell'aria, nel suolo, nell'acqua, nel ghiaccio, nelle sorgenti calde e perfino negli sbocchi idrotermali delle profondità oceaniche. 27/03/2017

Composizione tipica dei batteri Elementi %TSS Formula empirica (%VSS) 27/03/2017

Alghe verdi-azzurre Da non confondersi con le alghe. Sono cianobatteri ed appartengono al dominio dei BACTERIA. Sono organismi fotosintetici. 27/03/2017

Alghe Rientrano fra le alghe numerosi organismi eucariotici che contengono clorofilla e svolgono la fotosintesi. La maggior parte sono microscopiche (quelle di nostro interesse), sono presenti tuttavia organismi macroscopici di dimensione molto elevata. Le alghe contengono clorofilla e si presentano di colore verde, possono assumere colori diversi (marrone o rosso) per la presenza di altri pigmenti. Colonie di Volvox 27/03/2017

Protozoi I protozoi sono organismi eterotrofi generalmente unicellulari, sprovvisti di una ben delimitata parete cellulare. La maggior parte è mobile. Possono essere patogeni per l’uomo o per altri animali. 27/03/2017

Funghi Sono organismi eterotrofi pluricellulari, caratterizzati dalla presenza di una parete cellulare e dalla produzione di spore. I gruppi di maggiore importanza sono: muffe, lieviti e funghi fruttiferi. Muffe: Sono funghi con struttura filamentosa, caratteristici per le loro efflorescenze polverose di colore bianco-grigio, verdastro, nero. Si riproducono tramite spore che differiscono nella morfologia, nel modo in cui sono prodotte, nel colore. Le loro condizioni ottimali di pH sono di circa 5,6 con intervallo tra 2 e 9. Lieviti: Funghi unicellulari che vivono in habitat liquidi o umidi. 27/03/2017

Virus I virus non sono cellule ma particelle composte da acidi nucleici (DNA o RNA) racchiusi in un involucro proteico Il termine virus significa, “veleno” e venne usato per la prima volta per indicare particelle patogene più piccole dei batteri. Essi non possiedono molti degli attributi tipici delle cellule ed, in particolare, sono sistemi dinamici e aperti in grado di assimilare nutrienti ed espellere metaboliti. Sono parassiti intracellulari obbligati e solo quando infettano una cellula sono in grado di riprodursi. 27/03/2017

Metabolismo microbico Percorsi metabolici e conseguente classificazione dei microrganismi 27/03/2017

Il metabolismo dei microrganismi Un organismo per potersi riprodurre e funzionare correttamente ha bisogno di: Energia Carbonio Elementi inorganici (nutrienti) Fattori di crescita (amminoacidi, vitamine, basi azoto, …) Un organismo per potersi riprodurre e funzionare correttamente ha bisogno di: Energia; Carbonio per la sintesi di nuovo materiale cellulare; Elementi inorganici (nutrienti) come azoto, fosforo, zolfo, potassio, calcio e magnesio; Fattori di crescita, composti organici necessari, come i micronutrienti, in piccole quantità. Si tratta di vitamine, aminoacidi, purine e pirimidine. I composti che fungono da fonte di carbonio e di energia sono solitamente indicati come substrato. Il loro metabolismo è molto semplice: i nutrienti ed il substrato, vengono assimilati attraverso la membrana cellulare, sono rielaborati all’interno della cellula per ricavarne energia e, attraverso questa, fabbricare altro materiale cellulare, in assenza di substrato esterno utilizzano materiale nutriente di riserva accumulato all’interno della cellula stessa. 27/03/2017

Anabolismo e Catabolismo Le attività metaboliche seguono due percorsi metabolici diversi: cammino anabolico (consumo di energia), che è un processo assimilativo che comporta la sintesi dei componenti della cellula (biosintesi), cammino catabolico (rilascio di energia), che è un processo dissimilativo. Le sostanze assunte vengono degradate attraverso una serie di passaggi intermedi fino a prodotti stabili. In questi passaggi si rende disponibile l’energia necessaria per la crescita e il mantenimento. I due processi si completano l’uno con l’altro. 27/03/2017

Ossido riduzione Nei sistemi biologici la produzione e la conservazione dell’energia coinvolge reazioni di ossido-riduzione (redox). In queste si ha uno scambio di elettroni tra un elemento donatore che si ossida, ed un elemento accettore che si riduce. Le reazioni redox rispetto ad altre reazioni chimiche, hanno un valore più elevato della resa di energia per mole di reagenti coinvolti. Il metabolismo delle cellule utilizza reazioni chimiche che per questa ragione vengono definite come biochimiche. In biochimica le reazioni di ossido-riduzione coinvolgono spesso non solo di un elettrone ma di un intero atomo di idrogeno, che è costituito da un elettrone più un protone. Ogni reazioni di ossido-riduzione presuppone la presenza di una semireazione di ossidazione ed una semireazione di riduzione, non potendo essere presenti in soluzione elettroni isolati. Nel catabolismo il donatore di elettroni è anche detto fonte di energia. Tale energia è prodotta attraverso al reazione chimica durante la quale il donatore di elettroni viene ossidato. La quantità di energia prodotta dipende anche dalla natura dell’accettore e quindi complessivamente dalla coppia redox coinvolta nella reazione. 27/03/2017

ATP ATP  ADP + Pi + energia ADP + Pi + energia  ATP ATP (Adenosintrifosfato): è la molecola che nel metabolismo delle cellule svolge l’importante funzione energetica di accumulare energia fornita dal catabolismo e di fornirla successivamente per le reazioni metaboliche, comportandosi come una sorta di batteria. L’ATP è costituito da un gruppo adenosina e tre gruppi fosfatici. Quando l’ATP perde un gruppo fosfatico, la rottura del legame rilascia una grande quantità di energia e si forma ADP (adenosindifosfato). ATP  ADP + Pi + energia Con un meccanismo di ricarica l’energia fornita dal catabolismo viene accumulata dalla reazione inversa. ADP + Pi + energia  ATP È opportuno evidenziare l’importanza del fosforo che deve essere sempre presente per garantire lo svolgimento delle reazioni metaboliche. L’energia che viene prodotta nelle reazioni di ossido-riduzione deve essere accumulata per la varie funzioni cellulari che richiedono consumo di energia. Nelle cellule tale conservazione avviene attraverso legami fosfati. Il più importante composto fosfato è l’ATP 27/03/2017

ATP L’energia che viene prodotta nelle reazioni di ossido-riduzione deve essere accumulata per la varie funzioni cellulari che richiedono consumo di energia. Nelle cellule tale conservazione avviene attraverso legami fosfati. Il più importante composto fosfato è l’ATP 27/03/2017

ATP Illustrazione schematica del ruolo svolto dall’ATP nel metabolismo 27/03/2017

ATP ADP Schema del ruolo svolto dall’ATP nel metabolismo Reazioni Cataboliche Generazione di energia libera ATP SUBSTRATO (Fonte di Energia) Scambio di energia fosforilazione idrolisi ADP Reazioni Anaboliche Consumo di energia libera Prodotti metabolici Sintesi della biomassa Idrolisi ATP ATP+H2O ADP+Pi Fosforilazione ADP ADP+Pi ATP Metabolismo di mantenimento 27/03/2017

Enzimi e coenzimi Gli enzimi negli organismi viventi hanno il compito di velocizzare le reazioni biochimiche che, in loro assenza, avverrebbero in tempi lunghi non compatibili con il metabolismo cellulare. Si tratta di macromolecole, spesso di natura proteica, in grado di abbassare l’energia di attivazione delle reazioni catalizzate. Alcuni enzimi per svolgere la loro attività hanno necessità di un composto addizionale, che può essere costituito ioni inorganici o da molecole organiche dette coenzimi. Gli enzimi negli organismi viventi hanno il compito di velocizzare le reazioni biochimiche che, in loro assenza, avverrebbero tempi lunghi, non compatibili con il metabolismo cellulare. Alcuni enzimi per svolgere la loro attività hanno necessità di un composto addizionale, che può essere costituito da ioni inorganici o da molecole organiche dette coenzimi 27/03/2017

Enzimi Cinetica enzimatica La velocità della reazione globale aumenta proporzionalmente alla concentrazione del substrato e quindi del complesso E-S. Come si può notare dalla figura, questo incremento decresce sino al raggiungimento di un plateau in cui la concentrazione di S è così elevata da mantenere sempre saturo l’enzima; in queste condizioni la velocità di reazione per unità di enzimi (o batteri), V/E, è massima e pari a k. La relazione tra concentrazione di substrato e la velocità è stata studiata da Michaelis- Menten 27/03/2017

Nutrienti Elementi Forma più comune in natura Carbonio CO2, composti organici Azoto NH4+, NH3, NO3-, N2, composti organici azotati Idrogeno H2O, composti organici Ossigeno H2O, O2, composti organici Fosforo PO43- Zolfo H2S, SO42-, comp. organici, metalli solfati Potassio K + in soluzione o Sali di potassio Magnesio Mg2+ in soluzione o Sali di magnesio Sodio Na+ in soluzione o Sali di sodio Calcio Ca2+ in soluzione o Sali di calcio Ferro Fe2+ o Fe3+ in soluzione o come Sali di Ferro Le cellule dei microrganismi sono costituiti prevalentemente da acque e macromolecole. Il processo metabolico deve essere in grado di fornire gli elementi necessari per produzione di tale molecole. Tali elementi sono detti nutrienti. Quelli necessari in quantità maggiori sono detti macronutrienti, quelli richiesti in piccole quantità micronutrienti. Fra i macronutrienti il più importante è indubbiamente il carbonio, che è l’elemento fondamentale per la costituzione dei composti organici cellulari. Dopo il carbonio l’elemento più abbondante è l’azoto. Tali elementi sono presenti in natura sotto diverse forme non tutte utilizzabili dai diversi microrganismi. Fra i micronutrienti, alcuni necessari solo in traccia, abbiamo: cromo, cobalto, rame, selenio, manganese, molibdeno, nichel, tungsteno, zinco, ferro, vanadio. 27/03/2017

Classificazione dei microrganismi I principali elementi che devono essere considerati per la classificazione dei microrganismi sono: SORGENTE DI CARBONIO: viene convertito in materiale cellulare (protoplasma) DONATORE DI ELETTRONI (SUBSTRATO): alimenta la semireazione di ossidazione e rappresenta la fonte di energia nel cammino catabolico. ACCETTORE DI ELETTRONI: alimenta la semireazione di riduzione nel cammino catabolico. 27/03/2017

Fonte di Carbonio Eterotrofi: organismi che utilizzano come fonte il carbonio contenuto nei composti organici Autotrofi: organismi che utilizzano come fonte di carbonio la CO2 27/03/2017

Energia Le cellule richiedono energia per le attività di sintesi e di mantenimento. L’energia può essere ottenuta da tre fonti diverse: I microrganismi che utilizzano la luce come sorgente di energia sono detti FOTOTROFI; quelli che invece usano l’energia chimica sono definiti CHEMIOTROFI. Composti chimici organici Composti chimici inorganici Luce Chemiorganotrofi CHEMIOTROFI Chemiolitotrofi FOTOTROFI 27/03/2017

Energia

Classificazione in funzione del ruolo dell’ossigeno I diversi tipi di metabolismo possono essere distinti sulla base delle modalità con le quali viene prodotta l’energia necessaria per le funzioni vitali. In particolare sulla necessità o meno dell’ossigeno come accettore finale delle reazioni di ossido-riduzione. Metabolismo aerobico quando l’ossigeno funge da accettore finale degli elettroni (i microrganismi che sfruttano questo metabolismo sono detti AEROBICI) Metabolismo anaerobico quando viene utilizzato un accettore finale di elettroni diverso dall’ossigeno (i microrganismi sono detti ANAEROBICI). Un caso particolare di metabolismo anaerobico è quello in cui gli accettori finali di elettroni siano i nitriti e/o i nitrati. Si parla in questo caso di Metabolismo anossico (spesso svolto da microrganismi FACOLTATIVI, che cioè in presenza di ossigeno usano questo come accettore ed in sua assenza nitriti e nitrati). 27/03/2017

Respirazione e Fermentazione Respirazione: ossigeno molecolare o altro composto inorganico come accettore di e-. Il substrato organico viene ossidato a CO2. Fermentazione: assenza di un accettore di e- esterno. Vengono utilizzati gli stessi composti organici donatori. La fermentazione è caratterizzata in termini energetici da una resa inferiore alla respirazione (minore velocità di crescita ed inferiori rendimenti di sintesi) 27/03/2017

Condizioni potenziale redox 2 Substrato organico C N O 3 - , S 4 Respirazione anossica aerobica Fermentazione anaerobica Prodotti di fermentazione e POTENZIALE REDOX molto negativo debolmente negativo o circa zero positivo Accettore di elettroni Trasformazione del Carbonio Ossido-Riduzioni interne Flusso interno di e- 27/03/2017

Classificazione processi metabolici Tipo Reazione Fonte C Donatore e- Accettore e- Prodotti Aerobico eterotrofo Respirazione Aerobica Composti Organici O2 CO2, H2O Aerobico autotrorfo Nitrificazione CO2 NH4+, NO2- NO2-, NO3- Aerobico autotr. Ossidazione Ferro Fe (II) Fe (III) Ossidazione Solfuri H2S SO42- Facololtativo Eterototrofo Denetrificazione Anossica N2, CO2, H2O Anaeraerobico Eterotrofo Fermentazione Acida Composti organici VFA Anaerobico Eterotrofo Riduzione Ferro Fe(II), CO2, H2O Anaerobico Eterotrofo Riduzione Solfati H2S, CO2, H2O Metanogenesi Acidi Grassi Volatili (VFA) Metano Sulla base di quanto finora introdotto è possibile classificare i microrganismi chemiotrofi in funzione della fonte di carbonio, dell’accettore di e- e del donatore di e-. 27/03/2017

Definizione dei parametri cinetici 27/03/2017

Velocità e tasso di crescita Sia nei reattori batch, che in quelli a flusso continuo la velocità (rateo) di crescita dei batteri può essere definita dalla seguente relazione: in cui rg è la velocità di crescita batterica (massa/unità di volume x tempo) X è la concentrazione di microrganismi (massa/unità di volume)I Facendo riferimento al valore specifico (tasso) rispetto alla concentrazione X della biomassa si introduce il tasso di crescita: 27/03/2017

Velocità e tasso di respirazione endogena L’attività di respirazione endogena corrisponde all’utilizzo come fonte di carbonio ed energia lo stesso materiale cellulare. Tale fase è sempre presente in contemporanea con la crescita cellulare. Diventa l’attività prevalente quando il substrato è esaurito. La velocità (rateo) di respirazione endogena dei batteri è definita dalla seguente reazione: in cui rd è la velocità di respirazione endogena (massa/unità di volume x tempo) Facendo riferimento al valore specifico (tasso) rispetto alla concentrazione X della biomassa si introduce il tasso di respirazione endogena: 27/03/2017

Velocità di crescita netta La velocità di crescita netta è data dalla differenza fra quella di crescita e quella endogena (che comporta un consumo del materiale cellulare). r’g = rg - rd in cui rd è la velocità di respirazione endogena (massa/unità di volume x tempo) Facendo riferimento al valore specifico (tasso) rispetto alla concentrazione X della biomassa si introduce il tasso di crescita netta: ’ =  - kd 27/03/2017

Velocità di utilizzazione del substrato La velocità di utilizzazione del substrato (termine con cui spesso si indica il donatore di elettroni) rappresenta la velocità con cui i batteri utilizzano il substrato: in cui rsu è la velocità di utilizzazione del substrato (massa/unità di volume x tempo) S è la concentrazione del substrato (massa/unità di volume) Facendo riferimento al valore specifico (tasso) rispetto alla concentrazione X della biomassa si introduce il tasso di utilizzazione del substrato: 27/03/2017

Fattore di resa (rendimento di crescita) Una parte del substrato è convertito in prodotti inorganici ed organici finali mentre un’altra parte porta alla formazione di nuove cellule. La successiva relazione mette in relazione il tasso di utilizzazione del substrato (rsu massa/unità di volume x tempo) con rg il tasso di crescita batterico: In cui Y (massa/massa) è il fattore di resa. Tenendo conto che una parte del biomassa viene degradata a causa della respirazione endogena è utile introdurre il fattore di resa osservato Yobs: Per la comprensione del fattore di resa si faccia riferimento al diagramma relativo al trasferimento di energia che abbiamo visto precedentemente per un microrganismo eterotrofo aerobico. La biomassa realmente prodotta (biomassa netta) tiene conto della diminuzione dovuta alla respirazione endogena. 27/03/2017

Esempio di calcolo del fattore di resa Calcoliamo Y nel caso di un substrato noto (p.es. formaldeide CH2O) Peso molecolare del substrato CH2O = 30 Peso molecolare della biomassa C5H7NO2 = 113 Massa atomica C = 12 ; N = 14; H = 1; O = 16 Il fattore di resa può anche essere calcolato come: gCOD (nella biomassa prodotta) /gCOD (nel substrato degradato) 27/03/2017

Calcolo di Y in termini di COD Equivalenza COD/substrato: Equivalenza COD/biomassa: Pertanto Y: 27/03/2017

Tasso di crescita e concentrazione del substrato Una relazione empirica della relazione esistente fra il tasso di crescita della biomassa e la concentrazione di substrato, largamente utilizzata nella pratica, è quella ricavata da Monod derivata dalla cinetica enzimatica di Michelis-Menten: Sostituendo questa espressione nella definizione del fattore di resa si ha: Dove k è il tasso massimo di utilizzazione del substrato, pari a μmax/Y. Ks rappresenta il valore della concentrazione del substrato al quale corrisponde un tasso di crescita pari alla metà del tasso massimo. Si noti che Per S>>Ks  = max (cinetica di ordine zero) Per S<< Ks  = maxS/Ks (cinetica di ordine uno) 27/03/2017

Proprietà della cinetica di crescita 27/03/2017

Effetto della costante di semisaturazione KS = 10 KS = 50 KS = 100 All’aumentare del substrato disponibile il tasso di crescita aumenta fino ad un valore massimo. Si noti come in presenza di alti valori di Ks il rateo massimo di crescita si ottiene per valori più elevati dalla concentrazione del substrato, mentre con valori bassi di Ks si ottiene già con basse concentrazioni. 27/03/2017

Sostanze inibitrici dei processi di crescita Oggi le acque reflue raccolgono spesso sostanze tossiche (composti organici o metalli pesanti) che possono diventare inibitori della crescita microbica impedendo così il funzionamento dei sistemi biologici di depurazione. Tale effetto di inibizione si esplica, solitamente, superando una definita soglia di concentrazione. Per esempio, nel caso di microrganismi eterotrofi, alcune soglie sono riportate di seguito: Arsenico 0.05 mg/l; Cadmio 1 mg/l; Cromo tot. 10 mg/l; Cromo esa. 1 mg/l; Rame 1 mg/l, Piombo 0.1 mg/l; Mercurio 0.1 mg/l; Nickel 1 mg/l; Zinco 1 mg/l. Nel caso di microrganismi autotrofi nitrificanti le soglie sono inferiori. 27/03/2017