ITER DI PROCEDURA NEL LABORATORIO DI ANATOMIA PATOLOGICA ESAME ISTOLOGICO : esame estemporaneo mediante uso del criostato biopsie mirate su tessuti e\o su organi prelievi autoptici ESAME CITOLOGICO : esame su versamento interstiziale esame su urine esame su striscio vaginale agoaspirato 1 FASE PROPEDEUTICA 2 FASE PROPEDEUTICA DI LABORATORIO 3 FASE PRE-ANALITICA 4 FASE ANALITICA 5 FASE POST-ANALITICA 6 FASE INTERPRETATIVA 7 REFERTAZIONE

1 FASE PROPEDEUTICA ISTOLOGIA : richiesta esame da reparto o divisione ospedaliera interna o da medico esterno allegate notizie cliniche e patologiche circa la motivazione della richiesta di esame contestuale invio di reperto anatomico o istologico (vetrini di consulenza) esecuzione autopsia e relativi prelievi effettuata dal medico anatomo-patologo CITOLOGIA : richiesta esame da reparto o divisione ospedaliera interna o da medico esterno allegate notizie cliniche e patologiche circa la motivazione della richiesta di esame contestuale invio di campione citologico o di vetrino con striscio vaginale già eseguito dal ginecologo (preparazione ed anamnesi del paziente sottoposto ad agoaspirato in apposito ambulatorio)

2 FASE PROPEDEUTICA DI LABORATORIO ISTOLOGIA : ricezione biopsie e reperti classificazione e numerazione reperti su apposito registro interno annuale progressivo compilazione apposito modulo di profilo mirato riduzione reperti anatomici ad opera del medico in apposite cassettine per istologia procedura di fissazione dei tessuti in processatore automatico (autotecnico) (circa 15 h.) (accensione e preparazione del criostato negli esami estemporanei)

3 FASE PRE - ANALITICA ISTOLOGIA : inclusione in paraffina dei reperti in precedenza fissati preparazione microtomo e bagno termostatato stendi-sezioni raccolta sezioni istologiche di circa 3 µ su vetrini; loro fissazione in stufa a secco termostatata; procedimento deparaffinazione in solventi (per esame al criostato : riduzione reperto e taglio sezioni con loro immediata fissazione in metanolo)

4 FASE ANALITICA ISTOLOGIA : colorazione manuale o automatizzata delle sezioni su vetrino colorazione di routine E.-E. colorazioni speciali reazioni specifiche di immuno-isto-chimica montaggio vetrini in mezzo di inclusione idoneo (colorazione esame criostato) Controllo di qualità : uso di sezioni già risultate positive in qualità di controllo positivo controlli inter-laboratorio

5 FASE POST - ANALITICA ISTOLOGIA : apposizione etichette identificative sui vetrini contenenti le sezioni colorate archiviazione in apposite rastrelliere delle cassettine per istologia contenenti le inclusioni in paraffina consegna dei vassoi contenenti i vetrini e dei moduli di profilo mirato al medico anatomo-patologo specialista archiviazione dei vetrini diagnosticati in istoteche

6 FASE INTERPRETATIVA ISTOLOGIA : osservazione dei vetrini al microscopio ottico interpretazione e diagnosi da parte del medico anatomo-patologo specialista refertazione su apposito modulo di profilo mirato e relativa consegna in segreteria amministrativa Controllo di qualità : lettura vetrini incrociata tra medico lettore e medico revisore lettura alla cieca inter-laboratorio

7 REFERTAZIONE refertazione su apposito modulo in segreteria amministrativa archiviazione documentazione cartacea inserimento su personal computer del referto in archivio informatico dedicato per singola area di interesse (istologia; citologia; immunopatologia) archiviazione documentazione informatica consegna del referto dalla segreteria al reparto o al medico richiedente o al paziente

DOPO IL PRELIEVO -Tessuti Freschi inviati direttamente al patologo: perché e come. -Tessuti sotto vuoto Banche di tessuti: perché e come. Problemi connessi.

FISSAZIONE DEI TESSUTI La diagnosi istopatologica, che si basa sullo studio della morfologia, richiede l’ uso di fissativi idonei a preservare nello statu quo ante migliore possibile la struttura del campione. La fissazione di un tessuto fornisce quindi una immagine statica, la quale, benché non ne rappresenti proprio le caratteristiche dell’ aspetto in vivo, deve tuttavia essere costantemente riproducibile. Requisiti fondamentali del fissativo ideale : sicura preservazione della morfologia di base integrità della struttura antigenica impedimento di alterazioni biochimiche nei tessuti, per aggiunta o sottrazione di componenti chimiche opposizione ai processi autolitici e putrefattivi.

Fissazione Definizione Trattamento chimico che porta alla immobilizzazione e alla stabilizzazione di componenti tessutali con minima dislocazione ed estrazione dei composti nativi La FORMA delle cellule e dei tessuti deve venir conservata il più possibile simile alla condizione vitale

Fissazione Una fissazione ideale prevede: Stabilizzazione contro modificazioni successive indotte da trattamenti susseguenti quale l’inclusione in paraffina Simultaneità nel campione della reazione tessuto-fissativo ( rapida penetrazione e diffusione nei tessuti ) Riproducibilità del processo di fissazione nonostante differente composizione del tessuto Assenza di “anormali” componenti prodotti o estrazione di componenti native Rapidità di azione ( per evitare l’insorgere di autolisi ) Assenza di “sovra-fissazione”

Fissazione dei Tessuti Molto importante è lo spessore del campione di tessuto che non deve, in genere, superare i 3 mm, onde evitare che al centro del tessuto intervengano fenomeni degenerativi prima dell’arrivo del fissativo. Una buona fissazione, atto preliminare più importante della tecnica istologica, pena la perdita irreparabile del tessuto dipende: - dal tipo, dal pH e dalla concentrazione del fissativo usato, - dalla osmolarità e dalle forze ioniche in atto - dalla temperatura e dalla durata dell’intera operazione In genere i fissativi più usati intervengono sulle proteine e sui lipidi, mentre i glicidi, specie se a basso peso molecolare, vengono solo inclusi tra le proteine fissate e possono diffondere nell’acqua.

I fissativi si dividono in due classi a seconda che agiscano per: Fissazione Classificazione I fissativi si dividono in due classi a seconda che agiscano per: 1) Coagulazione: denaturazione irreversibile delle proteine, con nuove stabilizzazioni tra gruppi diversi di diverse proteine che reagiscono una con l’altra formando aggregati MODIFICANO in modo irreversibile la struttura terziaria 3 Modi:  movimento termico con distruzione della struttura secondaria e terziaria (calore)  repulsione elettrostatica tra parti diverse di una stessa proteina (acidi forti, sali di metallo)  rimozione di H2O con disidratazione (etanolo) La disidratazione con etanolo può seguire la fissazione per Cross-link

Fissazione 2) CROSS LINKING: ovvero la formazione di legami crociati tra polipeptidi all’interno di una stessa proteina o tra proteine vicine STABILIZZANO la conformazione nativa della proteina E’ un processo ADDITIVO, più o meno sensibile Tipico di ALDEIDI, CARBODIMIDE Utile anche in ME, Istochimica

FISSAZIONE DEI TESSUTI Tecniche di fissazione : per immersione, consistente nel sommergere il tessuto nel liquido fissativo, con rapporto volumetrico minimo tra fissativo e campione di 10 : 1 per perfusione, in assoluto la migliore da un punto di vista teorico - pratico, ma limitata all’ animale da esperimento o ad organi asportati in loco e con vasi integri per uso di vapori, secondo cui i tessuti si fissano grazie ai vapori che si liberano da una soluzione fissativa riscaldata, permettendo così una fissazione in situ (si evita in tal modo che alcune sostanze solubili possano diffondere in soluzione e disperdersi). Si usano fissativi altamente volatili come : formaldeide, glutaraldeide, acido osmico.

Fissazione dei Tessuti La Formalina: E’ il più diffuso ed usato fissativo in istopatologia, ad un valore di pH prossimo a 7.0. La formalina diviene monomerica ed idratata, una molecola di basso peso molecolare capace di penetrate rapidamente nei tessuti, con la formazione di gruppi idrossi-metile con le proteine, e con la formazione di legami di tipo metilenico tra catene polipeptidiche (cross-linking) Formalina al 10%: formaldeide polimerizzata in soluzione acquosa satura al 40% e successivamente diluita 1:10 (detta anche formaldeide 4%) Formalina salata: 100 ml di formaldeide al 40% + 9 g di NaCl + 900 ml di H20; è una soluzione isotonica che impedisce la coartazione ed il rigonfiamento cellulare Formalina nel tamponata: 100 ml di formaldeide 40% + 900 ml di H20 + 4 g di fosfato acido di sodio + 6.5 g di fosfato disodico anidro; impedisce l’acidificazione dei tessuti (fenomeno dovuto alla trasformazione della formaldeide in acido formico), mantenendo il pH a 7.0.

Modi di Applicazione ( 1 ) Immersione Il campione deve essere immerso in almeno 20 volte volume di fissativo Ottima fissazione se: dimensioni adeguate (< 3 mm di spessore) minimo intervallo tra asportazione e immersione (< 30 m ottimale) ( le cellule, tolte dall’organismo, non sono più ossigenate e muoiono in un tempo variabile)

Modi di Applicazione Immersione Importante il tipo di contenitore ( a bocca larga ) e le dimensioni. Importanti le indicazioni sul recipiente (non sul coperchio) Nome, data, Numero; provenienza

Modi di Applicazione ( 2 ) Perfusione a circolazione chiusa in forma liquida (aldeidi) Distanza tra vasi e cellule: max. 100 microns Diffusione: penetrazione del fissativo e raggiungimento della adeguata concentrazione nel tessuto. Dipende da: rapporto di diffusione del fissativo che a sua volta dipende da: Concentrazione Temperatura Natura dl fissativo Topografia del tessuto in rapporto al fissativo Tipo di tessuto Cross Link o coagulazione

Modi di Applicazione ( 3 ) Esposizione di cellule e tessuti disidratati (liofilizzati) a fissativi in forma gassosa (aldeidi) ad elevata temperatura ( 80°c ) Usata solo per applicazioni particolari in istochimica per rivelare amine biogene ( noradrenalina, serotonina, dopamina)

Fissazione dei Tessuti Fissativi alcolici Alcool etilico 95° Alcool etilico 95° ed etere etilico anaparti Alcool metilico Alcool metilico ed acetone anaparti L’alcool di per sé, per il basso potenziale di ossidazione e per la moderata capacità di penetrazione, non è un buon fissativo per istologia ( ma è meglio di niente ); determina eccessiva coartazione ed indurimento dei tessuti, denatura le proteine e coagula grossolanamente il citoplasma; pertanto si preferisce utilizzarlo in associazione con altre componenti onde ottenere un fissativo più efficace ed omogeneo. Si è soliti ricorrere all’alcool etilico 95° o all’alcool etilico 50° in egual volume al materiale prelevato come prefissaggio in citologia.

Fissazione dei Tessuti Miscele fissatrici a base di alcool: Liquido di Serra: composto da 2 parti di alcool etilico 95° ed 1 parte di formaldeide 40% cui si aggiungono poche gocce di acido acetico glaciale Liquido di Carnoy: costituito da 6 parti di alcool etilico 99°, 3 parti di cloroformio ed 1 parte di acido acetico glaciale Liquido di Clarke: composto da 3 parti di alcool etilico 99° ed 1 parte di acido acetico glaciale Formalina alcoolica di Lillie: costituita da 9 parti di alcool etilico 99° ed 1 parte di formaldeide 40%

Fissazione dei Tessuti Miscele fissatrici a base di acido picrico: Liquido di Bouin: composto dalla miscela di 15 parti di acido picrico in soluzione satura acquosa, 5 parti di formaldeide 40% ed 1 parte di acido acetico glaciale Liquido di Duboscq - Brasil: costituito da 150 ml di alcool etilico 80°, 60 ml di formaldeide 40%, 15 ml di acido acetico glaciale ed 1 g di acido picrico Entrambi sono fissativi molto penetranti; tuttavia, la presenza dell’acido picrico e di quello acetico è di ostacolo ad eventuali indagini retrospettive e di estrazione del DNA e, inoltre, scioglie facilmente la maggior parte delle calcificazioni presenti.

Rischi e precauzioni d’uso per i fissativi Formaldeide : Potenziale allergenico (cancerogenicità) per inalazione e contatto. Uso di cappe aspiranti. Alcool : Rischio incendi Glutaraldeide Ac. Picrico Sali di Mercurio Tetrossido di Osmio Importante: uso di armadi dedicati e quantità limitate.

Tempi d’uso per i fissativi Formaldeide 4% (= Formalina 10% ) Velocità di penetrazione = 0,5 cm in 24 Fissazione: Tempo varia a sec. delle dim. del frammento, da 3h a 24h Alcool etilico 95% : penetra lentamente nei tessuti freschi Fissazione: accettabile sono in cell. isolate e frammenti piccoli ( diam 1-2 mm)

INCLUSIONE DEI TESSUTI Tecnica di inclusione in paraffina : Si effettua di routine su campioni privi di problemi particolari, tenendo presente che, con essa, si rendono solubili e si asportano dai tessuti i grassi. La paraffina (a punto di fusione di 58 - 60 °C) è chimicamente inattiva e conserva bene i tessuti che devono essere disidratati con immersione in alcool etilico (70°, 95° 99°) e diafanizzati con solventi della paraffina (cloroformio, benzene, toluene, xilene) prima di venire impregnati in essa e successivamente inclusi in blocchetti. In genere, il processo di inclusione avviene mediante l’ uso di inclusori automatici, fatti funzionare in ore notturne, e di dispensatori di paraffina, utilizzati per ottenere dei blocchetti ben compatti che contengono il tessuto pronto per essere sezionato con gli appositi microtomi.

Disidratazione Chiarificazione ETANOLO METANOLO ACETONE PROPANEDIOLO Chiarificazione XILOLO BENZOLO CLOROFORMIO

Inclusione Paraffina Gelatina / Agar Celloidina Resine Idrosolubili (Metacrilati) Epossidiche

Congelamento dei tessuti Conservazione di tessuti e cellule Sostanze “Protettive” Glicerolo / DMSO Effetti del congelamento Metodi di congelamento Blocchi di metallo Produzione di “Neve CO2” Ghiaccio secco Appar. Termo-elettrici Gas liquidi (N2) METODO IDEALE FREON ISOPENTANO Conservazione di tessuti e cellule

METODI RAPIDI Metodo T (°C) Efficienza Tessuti in liquidi refrigerati in contatto di metalli Fluido organico In gas liquido (N2) In ghiaccio secco Liquido organico Raffreddamento Termo-elettrico Supporto metallico Raffreddato per conduzione a b - 196 - 79 - 30 - 40 Il più veloce Ottimale per la maggior parte delle applicazioni in M.O scarsa a: N-esano, isopentano, miscele di butano e pentano b: giaccio secco in miscela con etanolo, metanolo o acetone

Sezionamento Rischio ambientale Microtomo Criostato Ultra-microtomia M.E. Temp. ideali per i vari tipi di tessuto Lama Tratt. delle sezioni 1) Essicamento (+ fissazione) 2) Freeze drying o altri metodi

Freeze – Drying Freeze – Sobstitution (Liofilizzazione) Principi Applicazione ai tessuti Trattamento successivo Condiz. di congelamento Condiz. di liofilizzazione Temp. Tempo Trappola di N2O Inclusione in paraffina Fissazione in vapori Freeze – Sobstitution

SPARAFFINATURA DELLE SEZIONI Tecnica di preparazione delle sezioni in paraffina, di circa 3 µ, per essere colorate : E’ un procedimento atto ad assicurare che la paraffina, non miscibile con acqua ed alcool, venga eliminata ed il tessuto possa essere impregnato dal colorante. Quindi è necessario utilizzare dei solventi della paraffina ed idratare gradualmente il tessuto sino all’ H2O distillata. Nel caso in cui il colorante sia in soluzione alcoolica ci si arresta all’ alcool 95°. xilolo 5 ’ etanolo 100° 5 ’ etanolo 95° 5 ’ etanolo 70° 5 ’ etanolo 50° 5 ’ H2O distillata ––› ––› colorazione

Colorazione dei tessuti Composizione (Gruppi reattivi –SO4 / = PO4 / - COOH / - O / - S/ -NH3) Tipo di colorante / pH / Solventi / Additivi Tipo di legame Ionico (Salino – elettrostatico) Covalenti (tra non metalli = elettroni condivisi tra due atomi) Complessi es. gruppi aldeidici R. Schiff (atomo centrale con 1 o 2 legami) es Ag. Diammina Intermolecolari (van der Waal) tra colorante e tessuto

Colorazione dei tessuti Colorazione di macromolecole sulla base di cariche (ioniche) Componenti tissutali Coloranti Basofile Acidofile Neutrofile Cationici (basici) Anionici (acidi)

COLORANTI : DEFINIZIONE CROMOGENO ( Luce visibile 400-800 mm) Criteri di purezza Spettro Gruppi cromofori -N  -N azo c=c alkene N = O nitroso c=o oxo N - O2 nitro (gruppi auxocromi) es: -SH NOMENCLATURA coloranti NITRO AZO CHINONICI

Pratica di colorazione dei tessuti Technical quality Purified / Pure / Very pure Analytical grade Reattivi Purezza Acqua Etichetta sui reattivi Conservazione Scarto / Scaricamento

(Assorbimento colore osservato) Coloranti (Assorbimento colore osservato) Coloranti cationici Nuclei / Batteri pH 3-4 per la completa ionizzazione di gruppi di fosfato DNA / RNA (selettivo) es. col. GRAM Effetto di diversi fissativi / Concentrazione di sali ZIEL-NIELSEN + Cresyl-violetto + I2 - col. Rosso = Fucsina

COLORANTI COMPLESSATI CON METALLI (Lacche) EMATEINA ossidazione di ematossilina Compl. con AL EMALLUME (Mayer - Carazzi) Fe EMAT. HARRIS - Lillie progressive - Differenziazione Ematossiline regressive - pH

Colorazione dei tessuti Reazione di Blocco Ossidazione - Ossidanti Riduzione Acilazione / Alchilazione (form. di derivati acidi) Saponificazione (idrolisi di derivati acidi Deaminazione Deboli Medi Forti H2O2 / I2 Ac. Perform. Permanganato

COLORAZIONE DI ROUTINE IN ISTOLOGIA Ematossilina - Eosina sezioni in H2O distillata Emallume acido di Mayer, filtrato, 7’ lavare H2O di fonte 10’ soluzione satura Li2CO3 15” Eosina [0.25 %], acidificata con qualche goccia di CH3COOH 1’ lavare in H2O distillata 2’ disidratare in etanolo 95° 4’ disidratare in etanolo 100° 4’ (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada) Risultati : nucleo blu scuro; citoplasma rosso

Colorazione con coloranti basici La colorabilità dipende da vari fattori: pH disidratazione fissazione temperatura

Colorazione con coloranti basici pH della soluzione Tipo di colorante Tempo e temperatura Tampone Trattamento dopo la colorazione Dipende da: Aggregati di coloranti legati a gruppi acidi Legame ionico + f. van der Waal es. Blu di Toluidina Meccanismo: + - Visibile U.V. Alcool resist. Metacromasia

PAS H C OH H C O

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “ALCIAN BLU pH 2.5” sezioni in H2O distillata soluzione Alcian blu 8 GX [1% in CH3COOH 3 %] 30 ’ lavare in H2O distillata 5 ’ contrasto nucleare con NFR (rosso nucleare neutro [1 %] in solfato di alluminio [5 %] a caldo e filtrato] ) 2 - 3 ’ lavare in H2O distillata 5 ’ disidratare in etanolo 95° 4’ disidratare in etanolo 100° 4’ (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada) Risultati : nucleo rosso intenso; glico - proteine acide blu - verde; colorazione citoplasmatica di fondo rosa tenue

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “PAS (acido periodico di Schiff) e PAS Diastasi” sezioni in H2O distillata alcune sezioni possono essere pre-trattate con -amilasi (diastasi) [0.1 % in PBS] a 37 °C 30 ’ HIO4 (acido periodico) [0.5 - 1 % in H2O distillata] 15 ’ lavare in H2O distillata 5 ’ reattivo di Schiff (fucsina solforosa) 45 - 60 ’ lavare in metabisolfito di sodio [5 %] 2 ’ lavare in H2O di fonte 15’ contrasto nucleare con emallume 5 ’ lavare in H2O di fonte 15 ’ disidratare in etanolo 95° 4’ disidratare in etanolo 100° 4’ (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada) Risultati : nucleo blu scuro; glicogeno e glico-proteine neutre rosso magenta. Dopo pretrattamento con diastasi il glicogeno non si colora

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “ALCIAN - PAS (VIALLI)” sezioni in H2O distillata soluzione Alcian blu 8 GX [1% in CH3COOH 3 %] 30 ’ lavare in H2O distillata 5 ’ HIO4 (acido periodico) [0.5 - 1 % in H2O distillata] 15 ’ lavare in H2O distillata 5 ’ reattivo di Schiff (fucsina solforosa) 45 - 60 ’ lavare in metabisolfito di sodio [5 %] 2 ’ lavare in H2O distillata 10’ contrasto nucleare con ematossilina Carazzi 5 ’ lavare in H2O di fonte 15 ’ disidratare in etanolo 95° 4’ disidratare in etanolo 100° 4’ (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada) Risultati : nucleo blu scuro; glico - proteine acide blu - verde; glico - proteine, glicogeno e sostanze PAS+ rosso - magenta; collagene rosso; colorazione citoplasmatica di fondo rosa tenue; altre strutture giallo

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “METODO DELL’ OIL RED O x I LIPIDI” sezioni in H2O distillata immergere in alcool isopropilico 60 % 5’ soluzione di Oil Red O [0,5 % in 200 ml di alcool isopropilico 100°] agitata a caldo e filtrata 20’ differenziare in alcool isopropilico 60° 20” lavare in H2O di fonte 5’ eventuale colorazione nucleare con ematossilina 5’ lavare in H2O di fonte 10’ montare in glicerina e lutare Risultati : lipidi neutri ed esteri di colesterolo rosso; fosfolipidi rosa pallido; nuclei blu - scuro

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “METODO AL SUDAN NERO B x I LIPIDI” sezioni in H2O distillata immergere in alcool etilico 55 ° 5’ soluzione satura di Sudan nero B in alcool etilico 55 ° 40’ differenziare in alcool etilico 55° 20” lavare in H2O di fonte 5’ montare in glicerina e lutare Risultati : lipidi neutri blu - nero; con tale metodo si colorano anche gli steridi, gli acidi grassi, i fosfolipidi e i glicolipidi. I nuclei ed i proteoglicani acidi si colorano in bruno, tuttavia ben differenziato dal colore dei lipidi

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “METODO AL SUDAN III e SUDAN IV” sezioni in H2O distillata immergere in alcool etilico 70 ° 5’ soluzione satura in parti eguali di Sudan III e IV miscelata in alcool etilico 70 ° ed acetone in parti eguali 10’ differenziare in alcool etilico 50° 20” lavare in H2O di fonte 5’ Emallume acido di Mayer, filtrato, 7’ montare in glicerina e lutare Risultati : lipidi neutri da rosso ad arancio; nuclei blu - scuro

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “ORCEINA x FIBRE ELASTICHE” sezioni in H2O distillata immergere in soluzione contenente Orceina [1 g + 0.4 ml acido nitrico + 100 ml alcool etilico 95 °] 24 h lavare l’ eccesso di colorante in alcool etilico 85 ° 2’ lavare H2O distillata 10’ colorare con miscela contenente : [0.35 g Blu di alizarina acido + solfato di alluminio 10 g / 100 ml H2O distillata] 10’ soluzione acquosa di acido fosfomolibdico [5 % ] 20’ lavare H2O distillata 10’ soluzione contenente : [Orange G 2 g + verde luce 0.2 g + CH3COOH 2 ml /100 ml H2O distillata] 10’ lavare H2O di fonte 5’ disidratare in etanolo 100° 4’ (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada) Risultati : fibre elastiche bruno - rossastro; fibre muscolari e citoplasma violetto; fibre collagene e reticolari verde; eritrociti e mielina arancione; nuclei e strutture basofile blu scuro

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “METODO DI GOMORI PER IL RETICOLO” sezioni in H2O distillata ossidare in permanganato di K ( KMnO4 ) 5’ lavare in H2O di fonte 5’ soluzione di acido ossalico (C2H2O4) 1’ lavare in H2O di fonte 5’ mordenzare in Allume ferrico [2 %] 5’ lavare in H2O distillata soluzione di Argento nitrato (AgNO3) ammoniacale [10 %] al buio 5 - 8’ sviluppare in soluzione di formalina [10 %] 3’ lavare in H2O di fonte 5’ lavare in H2O distillata differenziare in Cloruro oro (HAuCl4) [1 %] 8 - 10’ lavare in sodio tiosolfato (Na2SO2O3) [5 %] 5’ lavare H2O di fonte 5’ contrasto nucleare con NFR (rosso nucleare neutro [1 %] in solfato di alluminio [5 %] a caldo e filtrato] ) 2 - 3 ’ disidratare in etanolo 95° 4’ disidratare in etanolo 100° 4’ (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada) Risultati : fibre reticolari nero; collagene ocra -bruno scuro; nuclei rosso intenso N. B. : non utilizzare strumenti metallici (pinzette)

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “ELASTIC - VAN GIESON” sezioni in H2O distillata ossidare con soluzione di KMnO4 (permanganato di K) 5’ lavare H2O di fonte 5’ soluzione di C2H2O4 (acido ossalico) 1’ soluzione di Weigert (resorcina - fucsina) a 60° C 120’ lavare H2O di fonte 10’ Emallume acido di Mayer, filtrato, 3’ lavare H2O di fonte 10’ soluzione satura Li2CO3 15” soluzione di Van Gieson (fucsina acida [1 %] 5 ml + acido picrico 95 ml) 3’ lavare H2O di fonte 5’ disidratare in etanolo 95° 4’ disidratare in etanolo 100° 4’ (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada) Risultati : fibre elastiche marrone scuro - nero; collagene rosa - rosso; connettivo giallo; nuclei blu scuro

MICROSCOPIA ELETTRONICA La M.E. utilizza il potere separatore, a brevissima lunghezza d’ onda, delle radiazioni elettroniche emesse dal cannone elettronico (Filamento di Tungsteno e cilindro di Wehnelt) che consentono di ottenere, in modo appropriato con lenti elettro-magnetiche, ingrandimenti lineari di 30.000 x ed oltre. M.E.T. = Microscopia elettronica a trasmissione; permette di ottenere l’ immagine elettronica, riprodotta su lastra fotografica o su schermo fluorescente, reale ed ingrandita di una sezione di tessuto (spessa da 10 a 100 nm), i cui punti possono essere attraversati o meno da un fascio di elettroni. M.E.S. = Microscopia elettronica a scansione; permette di ottenere un perfetto esame tridimensionale della superficie di un oggetto o un pezzo anatomico o biologico, scandendo il fascio di elettroni la superficie per linee successive, come un pennello elettronico. L’ immagine si ottiene direttamente su tubo a raggi catodici. L’ ingrandimento finale è da 20 a 100.000 x. Dato il potere di penetrazione molto basso degli elettroni, le sezioni devono essere ultra-sottili (60-150 nm), fissate in Tetraossido di Osmio o in Glutaraldeide, incluse in resina e colorate con sali di metalli pesanti(acetato di Uranile e citrato di Piombo), onde aumentare il contrasto dell’ immagine.

MICROSCOPIA ELETTRONICA “METODO DI PREPARAZIONE DEI CAMPIONI” fissare un frammento di 1 mm3 in glutaraldeide [2.5 %] in buffer cacodilato o in PBS a 4 °C 2-6 h lavare in PBS (3 cambi) 10’ post-fissazione in tetraossido di osmio [1.30 %] a 4 °C 2 h lavare in PBS 20’ disidratare i campioni in serie ascendente di alcool 2-3 h chiarificare in toluene o in ossido di propilene 1 h resina epossidica EPON + toluene [1 : 1] RT 12 h resina epossidica EPON RT 12 h inclusione in capsule di gelatina o di plastica e polimerizzazione in stufa a 60 °C 48 h taglio delle sezioni ultra-sottili con ultra-microtomo con lama di cristallo o di diamante le sezioni, di spessore appropriato, vengono raccolte su dei retini di rame circolari e di 3 mm di Ø colorare con acetato di uranile in soluzione acquosa satura 10’ lavare in H2O distillata colorare con citrato di piombo 10’ far seguire la disidratazione secondo le tecniche usuali osservare al M.E. Risultati : doppia colorazione con aumento del contrasto e maggior evidenza di particolari ultrastrutturali; immagini in bianco e nero e\o con tonalità di grigio.

Necessità di ottimale fissazione e colorazione delle varie componenti Citologia Finalità Necessità di ottimale fissazione e colorazione delle varie componenti Modalità di preparazione

Preparati citologici Striscio - Spatole Cervice uterina Citocentrifugati Cervice uterina Urine Versamenti Bronchi Vie bilari Polmone Mammella Tiroide Linfonodi Spazzolati Agoaspirati Microbiopsie

Citologia Analisi d’immagine Automatica Citometria di flusso Strisci Citocentrifuga Filtri Millipore Centrifugazione liquidi Inclusione di sedimenti Ago Spatole Anse

Agoaspirati Sedimenti Fissazione Inclusione Principali Fissativi Alcool Formalina O H- C H

COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA “PAPANICOLAOU” sezioni in H2O distillata Ematossilina di Harris, filtrata, 3’ lavare H2O di fonte 5’ soluzione alcool - acida a pH 3 (etanolo 70° + HCl) 10” lavare H2O di fonte 2’ soluzione satura Li2CO3 15” lavare H2O di fonte 10’ soluzione di etanolo 70° 2’ soluzione di etanolo 95° 2’ Colorare in Orange G 6 3’ etanolo 95° (2 cambi) 20” Colorare in EA 50 3’ disidratare in etanolo 95° 4’ disidratare in etanolo 100° 4’ (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada) Risultati : nucleo blu scuro; citoplasma variante tra il blu-verdastro (basofilia) ed il rosa-arancione\rosso chiaro (eosinofilia)

Col. Papanicolau Vantaggi ed eventi determinanti -Definizione dei dettagli nucleari -Trasparenza citoplasmatica -Differenziaione dei vari tipi cellulari -Corretta fissazione -Buona col. Nucleare -Coloranti con sol. altamente alcooliche -Adeguata diafanizzazione -Colorazione policromatica

Problemi di colorazione con Papanicolau Coloraz. Nucleare pallida -Insufficente rimozione di “fissativi a pellicola” (polietilen-glicole + alcool etilico) -azione decolorante di HCl -striscio parzialmente asciugato prima della fissazione

Problemi di colorazione con Papanicolau Coloraz. Nucleare pallida (2) -pH dell’acqua corrente poco alcalino -colorante troppo vecchio

Problemi di colorazione con Papanicolau 2)Coloraz. Nucleare troppo intensa -fissazione con alcool >95% -tempo di immersione in HCl troppo breve -striscio troppo spesso che trattiene il colore (N.B. è possibile decolorare)

Problemi di colorazione con Papanicolau 3)Coloraz. Citoplasmatica insoddisfacente -permanenza in alcool 70% troppo lunga = decolorazione -asciugatura dello striscio prima della fissazione = tutto rosa

Problemi di colorazione con Papanicolau 3)Coloraz. Citoplasmatica insoddisfacente -striscio di alterno spessore -tempo di coloraz. scarso o non scuotimento del cestello -scarsa col. con verde luce = sostituire o pH non 4,5-5

Problemi di colorazione con Papanicolau 4) Riscio di inquinamento e trasporto di cellule -filtrare i coloranti

COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA “GIEMSA” sezioni in H2O distillata Giemsa puro diluito in H2O al [10 o 20 %] 60’ differenziare in CH3COOH diluito (0.4 ml acido acetico glaciale \ 100 ml H2O) 10” lavare in H2O distillata differenziare in etanolo 95°, controllando al microscopio 10” arrestare la differenziazione con alcool iso-propilico 2’ (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada) effetto Giemsa : produce una particolare colorazione viola -rossastra della cromatina del nucleo a causa dell’ eosinato di Azur. La soluzione di Giemsa pura è formata da eosinato di Azur II, contenente eosinato di Azur B ed eosinato di blu di metilene sciolti anaparti. Risultati : DNA e RNA blu; sostanze acidofile rosso - arancio e proteo-glicani rosso - violetto * specialmente elettiva per le cellule del sangue *

COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA “GIEMSA modificato” sezioni fatte essiccare all’aria post-fissazione in metanolo 15’ lavare in H2O di fonte 5’ soluzione di Giemsa puro diluito al [15 %] in buffer fosfato a pH 6.8 (22 ml 0.5 M Na2HPO4 + 32 ml 0.5 M KH2PO4 / 1000 ml H2O distillata) 15’ lavare in H2O distillata (3 cambi) fare asciugare a secco chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada) Risultati : DNA e RNA blu; sostanze acidofile rosso - arancio e proteo-glicani rosso - violetto (eseguito specie su strisci)

COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA “GRAM” sezioni in H2O distillata cristalvioletto o violetto di metile [1 %] 1 - 2’ scolare eccesso di colorante soluzione di Lugol 3 0” lavare in H2O di fonte differenziare in soluzione di alcool - acetone 20” lavare in H2O di fonte fucsina basica o rosso neutro [1 %] 1 - 2’ lavare in H2O di fonte e tamponare con carta bibula disidratare in etanolo 100° 1’ (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada) Risultati : Batteri Gram + blu scuro; batteri Gram - rosso; colorazione di fondo rosa N. B. : porre attenzione alla differenziazione

COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA “ZIEHL - NEELSEN (KOCH)” sezioni in H2O distillata fucsina basica [10 ml di soluzione al 10 % in etanolo 100 °] in acido fenico [+100 ml fenolo 5 % in H2O distillata e filtrato]; flambare le sezioni sul bunsen sino a farle fumare lavare in H2O distillata differenziare in soluzione alcool - acida [HCl 3% in etanolo 70°] finché le sezioni non cedono più colore lavare in H2O di fonte 10 ’ blu di metilene [1 % in H2O distillata] 5 - 10 ’ lavare in H2O di fonte disidratare in etanolo 100° sino a che le sezioni non divengono blu pallide 2’ (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada) Risultati : Bacilli alcool - acido resistenti rosso; flora batterica e tessuti vari blu N. B. : porre attenzione alla differenziazione

INCLUSIONE DELLE CELLULE Tecnica di allestimento dei preparati citologici in celloidina : E’ un procedimento atto ad assicurare che tutto il materiale cellulare sia conservato durante i passaggi analitici, raccogliendo le cellule in un film di celloidina così da renderle compatte e non dispersibili. celloidina 10 % : sciogliere 10 g. di celloidina in fiocchi in 50 ml di alcool etilico 99° e poi aggiungere 50 ml di etere (conservare in recipiente di vetro ben sigillato) riempire di celloidina 10 % una provetta in propilene, svuotarla, capovolgerla per allontanarne l’ eccesso onde ottenerne uno strato di 20 - 50 µ. di spessore (cell - bag) riempire la provetta di cloroformio che indurisce la celloidina e svuotarla di quest’ ultimo prima dell’ uso riempire la provetta con la sospensione cellulare, tappare e centrifugare allontanare il surnatante, estrarre delicatamente il cell - bag, ridurne le dimensioni per facilitarne l’ alloggiamento nelle cassettine citologiche ed includere in paraffina.

COLORAZIONE DI ROUTINE IN CITOLOGIA Ematossilina - Eosina sezioni in H2O distillata Ematossilina di Harris, filtrata, 3’ lavare H2O di fonte 5’ soluzione alcool - acida a pH 3 (alcool 70° + HCl) 10” lavare H2O di fonte 2’ soluzione satura Li2CO3 15” lavare H2O di fonte 10’ Eosina [0.25 %], acidificata con qualche goccia di CH3COOH 1’ lavare in H2O distillata 2’ disidratare in etanolo 95° 4’ disidratare in etanolo 100° 4’ (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada) Risultati : nucleo e batteri gram + blu scuro; citoplasma ed emazie rosa-rosso.

COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA “ARGENTO - METENAMMINA x I MICETI” sezioni in H2O distillata ossidare le sezioni in HIO4 [0.5 % in H2O distillata] 15 ’ lavare in H2O distillata 5 ’ mettere le sezioni al buio a 60 °C nella soluzione argentica pre-riscaldata (10 ml di metenammina [3 %] + 0.5 ml di AgNO3 [5 %] + 1.2 ml di Borace [5 %]) 60 - 90 ’ lavare in H2O di fonte 5 - 10 ’ HAuCl4 (cloruro oro) [1 %] 2 - 3 ’ sodio tiosolfato [3 %] 2 - 3 ’ lavare in H2O di fonte 5 - 10 ’ verde di metile [1 %] 5 - 10 ’ disidratare in etanolo 95° 4 ’ disidratare in etanolo 100° 4 ’ (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada) Risultati : miceti in nero; nucleo verde intenso

COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA “ARGENTO - METENAMMINA - PAS” sezioni in H2O distillata soluzione Ammoniaca [2 %] in etanolo 95° overnight ossidare le sezioni in HIO4 [0.5 % in H2O distillata] 15 ’ lavare in H2O distillata 5 ’ mettere le sezioni al buio a 60 °C nella soluzione argentica filtrata e pre-riscaldata : (25 ml H2O distillata + 2 ml di Borace [5 %] + 25 ml soluzione stock : (100 ml di metenammina [3 %] + 5 ml di AgNO3 [5 %]) controllare al microscopio 30’ - 40 ’ HAuCl4 (cloruro oro) [0.2 %] 2 - 3 ’ lavare in H2O di fonte 5’ sodio tiosolfato [2 %] 2 - 3 ’ lavare in H2O distillata 5 ’ liquido di Bouin a 60 °C 30’ lavare in H2O di fonte 10’ soluzione di acido Fosfotungstico [2 %] 1 - 2’ soluzione di cromotropo 2 R : (100 ml. HCl 0.1M + 0.3 g. cromotropo 2 R) 15 ’ lavare in H2O distillata 5 ’ disidratare in etanolo 95° 3 ’ disidratare in etanolo 100° 3 ’ (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo d’inclusione neutro Risultati : miceti in nero; membrane basali in nero; background in rosso

COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA “METODO DI MANN - DOMINICI” sezioni in H2O distillata soluzione di Lugol 5’ decolorare in iposolfito di sodio [5 %] 2’ lavare in H2O di fonte 5’ lavare in H2O distillata soluzione Dominici (Orange G [1 %] + eritrosina [0.2 %] + 0.05 ml CH3COOH) 10 - 15’ soluzione di blu di toluidina [0.5 %] 2 - 3’ lavare in H2O di fonte 3’ differenziare in CH3COOH sino a che le sezioni virano al rosa disidratare in etanolo 95° 4 ’ disidratare in etanolo 100° 4 ’ (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada) Risultati : nuclei blu scuro; eritrociti giallo - arancio; connettivo rosso; granulociti eosinofili rosso; granulociti neutrofili viola; granulociti basofili blu elettivo per il tessuto emopoietico, i linfomi ed i midolli

COLORAZIONE IN CITO-GENETICA “METODO ALL’ ORCEINA ACETICA” sezioni in H2O distillata soluzione contenente Orceina acetica [ 2 %] ( 90 ml CH3COOH puro + 2 g orceina + 100 ml H2O distillata 30’ lavare in CH3COOH [45 %] 1’ lavare in alcool butilico terziario 2’ soluzione di xilolo ed alcool butilico terziario 1 : 1 2’ chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada) Risultati : i cromosomi si colorano in rosso - porpora una variante con l’ aggiunta di fast green e ripetuti ed accurati passaggi in alcool a vario grado è utilizzata per identificare la cromatina sessuale che si colora in rosso ed il citoplasma in verde chiaro.

Microscopia a fluorescenza Piccole quantità Illuminazione con luce a  breve Emissione nel visibile Fluorescenza Filtri Fluoroforo (Fluorocromo) Fosforescenza Eccitazione / Sbarramento Caratt. Spettro di Assorbimento Caratt. Spettro di Emissione

Tipi di Fluorescenza Autofluorescenza O Fluorescenza indotta - Amine biogane + C  carboline H N Fluorocromi - effetto “QUENCNING” - vantaggi caratteristici DNA ACRIDINE ORANGE (verde) RNA Rosso METACROMASIA concentrazione polimeri 1 maggiore A.O. Citologia METACROMASIA MASCHERATA - fibre elastiche - LIPOFUSCINE - NADH2 - Porfirine - Vit. A - Farmaci Tetracicline Adriamicina Chinacrine Benzopirene

Reagenti di SCHIFF Fluorescenti ALDEIDI FUCSINA BASICA (para-rosanilina) Tioflarina T AMILOIDE PROCION yellow cellule (neuroni) BANDEGGIO CROMOSOMICO COL. SOPRAVITALE cell sorting IMMUNOFLUORESCENZA Lampade Problemi di DECADENZA FOTOGRAFIA Liq. di montaggio VETRI XENON MERCURIO

Gruppi reattivi dimostrabili su sezioni Importanza in patologia diagnostica Acidi Nucleici M.O. Ordinaria M. Fluorescenza (Acridina Orange) Metacromasia Coloraz. con coloranti basici Valutazione Quantitativa (Microspettrofotometria) Controlli con trattamento enzimatico (RNAsi - DNAsi) Reaz. Di FEULGEN

Metodi per la dimostrazione di acidi nucleici Metodi qualitativi quantitativi Interesse in patologia VIRUS Distribuzione del DNA Met. Feulgen

COLORANTI COMPLESSATI CON METALLI (Lacche) CROMO-GALLOCIANINA Reaz. di FEULGEN per legame purina - Desossiriboso Idrolisi acida Formaz. di gr. aldeidici Frammentazione del DNA Concentrazione HCl Temperatura Sensibilità Specificità di - reazione - localizzazione

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “FEULGEN reazione” sezioni in H2O distillata idrolisi in HCl 1 N a 60 °C per un tempo ottimale in relazione al fissativo usato da 4’ a 25’ (usare anche HCl 5 N a RT) (10’) lavare in HCl 1 N freddo e poi in H2O distillata reattivo di Schiff 40’ - 60’ lavare in metabisolfito di sodio [5 %] 2’ lavare in H2O di fonte 15’ contrasto citoplasmatico con verde luce [1 %] 1’ lavare in H2O di fonte 2’ disidratare in etanolo 95° 4’ disidratare in etanolo 100° 4’ (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada) Risultati : il DNA si colora in modo elettivo in rosso magenta; citoplasma verde

Metodi per la dimostrazione di acidi nucleici Metodi qualitativi quantitativi Interesse in patologia VIRUS Distribuzione del DNA Met. Feulgen

Valutazione quantitativa Cell Luce Principi Variazione di assorbimento Lunghezza d’onda

Metodi alternativi TIMIDINA TRIZIATA - Ibridizzazione in situ BRDU TIMIDINA TRIZIATA - Ibridizzazione in situ - Immunocitochimica - Autoradiografia - Citofluorimetria cell sorter  Laser

Autoradiografia Principi Potere di risoluzione Stripping Emulsione Marcatori H3 / P4 / S

Tempo di Esposizione Principi Timidina H3 Ibridizzazione in situ (Conteggio granuli / fondo) Timidina H3 Ibridizzazione in situ Legame di affinità

Ibridizzazione in situ (ISH) Dimostrazione di geni su cromosomi (FISH) mRNA specifico - gene espressione (vantaggi rispetto a ICC) RNA / DNA virale Metodi - Sonde - S - H - pH Riboprobes Oligos Marcatura - Raidoatt. Auto-radiografia Non radioatt. Biotina Digoxiganina Fluorescina ICC

IBRIDIZZAZIONE IN SITU I S H Questa tecnica consente di identificare specifiche sequenze di DNA ed RNA e di rivelare in quali cellule tali sequenze sono espresse. La metodica si basa sulla capacità della doppia elica del DNA di dissociarsi (quando riscaldata a 80-100°C, o esposta ad ambiente basico a pH 13)[DENATURAZIONE] per poi ricostituirsi, partendo da due singole eliche complementari [IBRIDIZZAZIONE]. Se una delle due emieliche è marcata, si può rendere visibile l’ avvenuta ibridizzazione di doppie eliche neoformate costituite da probe e da acidi nucleici ad esso complementari. La marcatura del DNA avviene chimicamente per inserzione di un gruppo sulfone in 5 sull’ anello della Citosina che reagisce con un AbMc anti-sulfone, e quindi con un 2° Ab coniugato a fosfatasi alcalina (N.B. : inibire la fosfatasi alcalina endogena con esposizione ad 80° C x 5’). Il trattamento con DNasi e\o RNasi elimina la comparsa di positività, mentre quello con solo uno dei due enzimi evidenzia selettivamente un unico tipo di acido nucleico.

Ibridizzazione in situ (ISH) Sensibilità Localizzazione (Definizione) Conservazione strutturale Problemi Esami genico su singole cellule prelevate da sezioni (necessità di identificazione del tipo di cellule) Sistemi laser / catapulta

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “METODO DI GOMORI PER LA MELANINA” sezioni in H2O distillata trattare in soluzione di Lugol 10’ lavare in H2O distillata 5 ’ mettere le sezioni al buio a 60 °C nella soluzione argentica pre-riscaldata (10 ml di metenammina [3 %] + 0.5 ml di AgNO3 [5 %] + 1.2 ml di Borace [5 %]) 60’ - 90 ’ o 18-24 h. al buio RT lavare in H2O di fonte 5 - 10 ’ HAuCl4 (cloruro oro) [1 %] 2 - 3 ’ sodio tiosolfato [3 %] 2 - 3 ’ lavare in H2O di fonte 5 - 10 ’ contrasto nucleare con NFR (rosso nucleare neutro [1 %] in solfato di alluminio [5 %] a caldo e filtrato] ) 2 - 3 ’ disidratare in etanolo 95° 4 ’ disidratare in etanolo 100° 4 ’ (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada) Risultati : granuli di melanina nero; cheratina arancio; nuclei rosso intenso

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “PERLS x IL FERRO” sezioni in H2O distillata soluzione di Ferrocianuro di K [10 %] 5’ soluzione di Ferrocianuro K [10 %] + HCl [10 %] (70 ml + 30 ml) 25’ lavare H2O di fonte 5’ lavare H2O distillata contrasto nucleare con NFR (rosso nucleare neutro [1 %] in solfato di alluminio [5 %] a caldo e filtrato] ) 2 - 3 ’ lavare H2O di fonte 5’ disidratare in etanolo 95° 4’ disidratare in etanolo 100° 4’ (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada) Risultati : i depositi di ferro si colorano in blu; i nuclei in rosso intenso N. B. : non utilizzare strumenti metallici (pinzette)

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “PER IL RAME” sezioni in H2O distillata soluzione di lavoro di Rhodanina [0.3 % in etanolo 100°] (6 ml / 100 ml H2O distillata) a 60° C 120 - 180’ lavare H2O di fonte 5’ lavare H2O distillata contrasto nucleare con ematossilina Carrazzi 1’ lavare in soluzione di Borace [0.5 %] (tetraborato di sodio) 2’ lavare H2O distillata disidratare in etanolo 95° 4’ disidratare in etanolo 100° 4’ (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada) Risultati : depositi di rame color rosa - rosso; nuclei blu scuro

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “METODO DI Von KOSSA x IL CALCIO” sezioni in H2O distillata soluzione acquosa di AgNO3 (nitrato Argento) [3 %] 60’ sviluppare in una soluzione di idrochinone [0.5 %] 3’ lavare H2O di fonte 5’ fissare in una soluzione di tiosolfato di sodio [5 %] 3’ lavare H2O distillata contrasto nucleare con NFR (rosso nucleare neutro [1 %] in solfato di alluminio [5 %] a caldo e filtrato] ) 2 - 3 ’ lavare H2O di fonte 5’ disidratare in etanolo 95° 4’ disidratare in etanolo 100° 4’ (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada) Risultati : sali di calcio (fosfati e carbonati) nero; nuclei rosso intenso N. B. : non utilizzare strumenti metallici (pinzette)

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “DI FOUCHET x LA BILE” sezioni in H2O distillata soluzione di lavoro secondo Fouchet : (acido Tricloroacetico (C2HCl3O2) [25 %](50 ml) + Cloruro ferrico (FeCl3) [10 %]( 5 ml) 5 - 10 ’ lavare H2O distillata soluzione di Van Gieson (fucsina acida [1 %] 5 ml + acido picrico 95 ml) 3’ lavare H2O distillata disidratare in etanolo 95° 4’ disidratare in etanolo 100° 4’ (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada) Risultati : biliverdina color verde; collagene rosa - rosso; connettivo giallo

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “LUXOL FAST BLUE” sezioni in H2O distillata soluzione di Luxol Fast Blue 2 G [0.1 % in alcool isopropilico] 60’ disidratare in alcool isopropilico assoluto 5’ (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada) Tale colorazione, sebbene poco specifica per i fosfolipidi, li colora in modo soddisfacente, specie se disciolti in alcool isopropilico e quindi fornisce ottima colorazione della mielina integra (costituita dalla membrana cellulare della cellula di Schwann). Risultati : la mielina appare in blu

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA ISTOCHIMICA - ENZIMATICA : “CLORO - ACETATO ESTERASI” PREPARAZIONE SOLUZIONI sol. A : Naftolo AS-D Cloroacetato [10 mg.] + Dimetilformamide [1 ml.] sol . B : buffer fosfato0.1 M [30 ml.] sol. C : Pararosanilina - HCl : Pararosanilina idrocloride [2 g.] + HCl 2n [50 ml] (sciogliere a caldo, raffreddare e filtrare) sol. D : Sodio Nitrato [400 mg.] + H2O distillata [10 ml.] sol. E : “working” Pararosanilina - HCl : sol. C [0.4 ml.] + sol. D [0.4 ml.] sezioni in H2O distillata soluzione substrato : ( 0.8 ml. sol. E + 30 ml. sol. B; sistemare il pH a 6.3 e aggiungere la sol. A; mescolare e f iltrare) 1’ - 2’ lavare con H2O distillata 5’ Emallume acido di Mayer, filtrato, 5’ lavare H2O di fonte 10’ soluzione satura Li2CO3 15” lavare H2O di fonte 10’ disidratare in etanolo 95° 4’ disidratare in etanolo 100° 4’ (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in resina sintetica Risultati : l’attività enzimatica dell’ esterasi appare in rosa - rosso; i nuclei in blu - scuro

SICUREZZA IN LABORATORIO CONSIDERARE OGNI CAMPIONE BIOLOGICO COME POTENZIALMENTE INFETTO SOTTOPORSI ALLE PRINCIPALI VACCINAZIONI USARE CAMICI, GUANTI, CALZARI E MASCHERE PROTETTIVE USARE GUANTI ED OCCHIALI APPOSITI NEL MANEGGIARE AZOTO LIQUIDO USARE GUANTI ANTI-TAGLIO AL MICROTOMO E AL CRIOSTATO USARE CAPPE DI ASPIRAZIONE CON FILTRI SPECIFICI PER FORMALDEIDE E PER XILENE USARE GUANTI E LAME MONOUSO PER DISSEZIONE USARE MASSIMA CAUTELA NELL’ IMPIEGO DI ULTRA-CENTRIFUGHE, FORNO A MICROONDE, AUTOCLAVE, STIRRER ED APPARECCHIATURE ELETTRICHE DA LABORATORIO IN GENERE EVITARE DI CONTAMINARE IL PROPRIO POSTO DI LAVORO E TENERLO IL PIU’ PULITO POSSIBILE CONTROLLARE PERIODICAMENTE IL SISTEMA ANTI-INCENDIO, I SISTEMI DI ALLARME GAS E L’ ACCESSO ALLE VIE DI FUGA OSSERVARE CORRETTA VENTILAZIONE E RICAMBIO ARIA LOCALI NON FUMARE E NON CONSERVARE O CONSUMARE CIBI IN LABORATORIO

RISCHI AMBIENTALI IN LABORATORIO RISCHIO BIOLOGICO : TUBERCOLOSI; BATTERI PIOGENI PER AEROSOL; VIRUS EPATITE - HBV - HCV-; HIV (AIDS); INFEZIONI DA LEGIONELLA E DA BLASTOMYCES; DERMATITI. RISCHIO CHIMICO : ESPOSIZIONE A FORMALDEIDE (oltre 1 ppm) e\o GLUTARALDEIDE; ESPOSIZIONE TOSSICA VERSO SOLVENTI ORGANICI (Xilene, Toluene, Benzene, Cloroformio, Alcool....); ESPOSIZIONE VERSO AMINE AROMATICHE(principali coloranti : ponceau,verde luce, fast red, sudan IV, blu toluidina.......); ESPOSIZIONE VERSO LA DAB (benzidina - derivato); ESPOSIZIONE VERSO I METACRILATI (resine per inclusione in M.E., tossiche e corrosive); ESPOSIZIONE ALLERGICA VERSO IL LATTICE. RISCHIO NUCLEARE : ESPOSIZIONE VERSO ISOTOPI RADIOATTIVI USATI NEL MARCARE I PROBES (3H, 14C, 45Ca, 32P, 90Sr, 35S, 131I). RISCHIO FISICO : PUNTURE, TAGLI, LACERAZIONI ED ABRASIONI CUTANEE(nell’ uso del microtomo o nella dissezione in sala anatomica); ESPLOSIONI ED INCENDI ACCIDENTALI (nella preparazione di reattivi o nello stoccaggio degli alcool), ATTI DOLOSI E CADUTE ACCIDENTALI.

ARTEFATTI ISTOLOGICI Definizione Difetti o anomalie dei tessuti, da riferire non ad un processo naturale (fisiologico o patologico) ma all’introduzione di materiali estranei, a procedure non corrette di fissazione, inclusione, sezionamento, colorazione, montaggio dei vetrini. E’ importante riconoscere gli artefatti, per evitare di interpretarli (e diagnosticarli) come un processo patologico o una malattia del paziente.

ARTEFATTI ISTOLOGICI 1)Artefatti causati prima del prelievo: 1.1. Polvere di talco 1.2. Materiale di sutura 1.3. Effetto da termocauterio 1.4. Effetto da agenti chimici 1.5. Particelle di carbone 6. Garza 1.7. Essicamento

ARTEFATTI ISTOLOGICI 2) Artefatti causati nell’intervallo tra il prelievo ed il trattamento istologico 2.1. Effetti di schiacciamento 2.2. Essiccazione 2.3. Congelamento 2.4. Chinatura 2.5. Introduzione di materiali estranei quali grani di polvere

ARTEFATTI ISTOLOGICI 3) Artefatti durante la fissazione 3.1. Autolisi durante la fissazione 3.2. Fissazione inadeguata o incompleta 3.3. Effetti da fissazione con Fiss. di Zenker (coartazione) 3.4. Deposito di cristalli di Sublimato mercurico 3.5. Effetti di estrazione da fissazione in formalina 3.6. Depositi di Emateina acida da fiss. in formalina

ARTEFATTI ISTOLOGICI 4)Artefatti legati a procedure di inclusione 4.1. Inadeguata fissazione 4.2. Inadeguata disidratazione 4.3. Presenza di residui di liquidi chiarificanti 4.4. Inadeguata infiltrazione di paraffina 4.5. Uso di paraffina troppo calda

ARTEFATTI ISTOLOGICI 5) Artefatti legati alle procedure d’inclusione 5.1. Inclusione di frammenti multipli di diversa durezza 5.2. Orientamento scorretto dei frammenti 5.3. Prolungata esposizione a paraffina sciolta

ARTEFATTI ISTOLOGICI 6)Artefatti da sezionamento erroneo 6.1. Angolo di taglio sbagliato 6.2. Lama o blocchetto mal fissati (effetto “tende alla veneziana”) 6.3. Lame poco affilate 6.4. Raccolta di frammenti di tessuto anomalo “pesci”

ARTEFATTI ISTOLOGICI 7) Errori nella raccolta delle sezioni sui vetrini 7.1. Contaminazione dei vetri da muffe o pollini 7.2. Uso di quantità eccessive di adesivo 7.3. Raccolta di frammenti di altri blocchetti 7.4. Pieghe nelle sezioni 7.5. Bolle d’aria sotto le sezioni 7.6. Uso di acqua troppo calda per stendere le sezioni

ARTEFATTI ISTOLOGICI 8) Artefatti da colorazione I 8.1. Mancata sparaffinatura 8.2. Effetti di bolle tra sezione e vetro 8.3. Sbagli nella colorazione con: 8.4. Ematossilina di Harris 8.5. Emallume di Mayer 8.6. Eosina 8.7. Imperfetta disidratazione prima del montaggio

ARTEFATTI ISTOLOGICI 8) Artefatti da colorazione II Sbagli nelle colorazioni speciali: 8.5. PAS 8.6. PAS-diastasi 8.7. Rosso Congo 8.8. Giemsa 8.9. Feulgen 8.10. Metenamina-argento per i funghi

ARTEFATTI ISTOLOGICI 9) Errori nel montaggio con coprioggetto 9.1. Contaminazione del liquido di montaggio 9.2. Uso di coprioggetto troppo piccoli 9.3. Erroneo posizionamento del vetrino 9.4. Intrappolamento di bolle d’aria 9.5. Montante troppo abbondante 9.6. Montante troppo scarso

ARTEFATTI IN CITOLOGIA c.1.) Errori nella raccolta delle cellule c.1.1. Cellule sovrapposte c.1.2. Cellule troppo rade c.1.3. Eccessiva quantità di sangue c.1.4. Mancato uso di adesivo c.1.5. Effetto da citocentrifuga c.1.6. Contaminazione batterica (nelle urine) c.1.7. “Stiramento” delle cellule per compressione

ARTEFATTI IN CITOLOGIA c.2.) Errori nella fissazione delle cellule c.2.1. Effetti di essiccamento prima della fissazione (nella col. di Papanicolau) c.2.2. Effetti di essiccamento troppo lento (nella col. di Giemsa)

ARTEFATTI IN CITOLOGIA c.3) Errori nella colorazione delle cellule con la col. di Papanicolau c.3.1. Col. Nucleare troppo debole c.3.2. Col. Nucleare troppo intensa c.3.3. Col. con Orange G troppo debole c.3.4. Col. con Orange G troppo intensa c.3.5. Col. con Verde luce troppo debole c.3.6. Col. con Verde luce troppo intensa

ARTEFATTI IN CITOLOGIA c.4) Errori nel montaggio con coprioggetto c.4.1. Contaminazione del liquido di montaggio c.4.2. Uso di coprioggetto troppo piccoli c.4.3. Erroneo posizionamento del vetrino c.4.4. Intrappolamento di bolle d’aria c.4.5. Montante troppo abbondante c.4.6. Montante troppo scarso