FACOLTA’ DI SCIENZE MATEMATICHE FISICHE E NATURALI Corso di Laurea magistrale in Neurobiologia “Caratterizzazione del comportamento materno in un modello murino di autismo idiopatico e ruolo dell'ossitocinaˮ CandidatoMaria Carla Giorgi Relatore internoProf. Andrea Mele Relatore esternoDott.ssa Gemma Calamandrei Anno Accademico

COMPORTAMENTO MATERNO ʺ Il più importante comportamento sociale delle femmine di mammifero ʺ (Bosch & Neumann, 2012) La sopravvivenza della prole

Comportamenti diretti verso i piccoli Nursing Arched back nursing Licking Contact with pups Nest-building Comportamenti NON diretti verso i piccoli Eating Drinking Self-grooming Immobility Digging

La quantità e la qualità delle cure materne influenza lo sviluppo neurocomportamentale della prole Vulnerabilità allo stress Apprendimento e memoria Comportamento sociale

Obiettivi della ricerca Caratterizzare la responsività materna in un modello murino di disturbo dello spettro autistico, sia in assenza che in presenza della appropriata stimolazione ormonale; Valutare l’attivazione di alcune aree cerebrali coinvolte nel comportamento materno e il relativo ruolo dell’ossitocina

Modello murino:BTBR T+ tf/J Fenotipo:  Disturbi nella sfera sociale e comunicativa: scarsa motivazione all’interazione sociale  Presenza di comportamenti stereotipati e ridotta flessibilità comportamentale  Assenza corpo calloso  Aumentati livelli di ossitocina in ipotalamo  Anomalie nella trasmissione serotonergica;  Elevati livelli basali di CORT;  Alti livelli di citochine proinfiammatorie;  Elevati livelli dei recettori per i glucocorticoidi in CA1. C57B6/J

ESPERIMENTO 1 INDUZIONE MATERNA IN FEMMINE VERGINI latenza approach; sniffing; retrieving; crouching; nest-building Osservazione dei comportamenti diretti e non diretti verso i piccoli Analisi dell’ espressione gene c-fos e OXT in MPOA, PVN e OB di femmine con comportamento materno completo Comportamento materno completo: almeno 4 Comportamento materno parziale: almeno 3 Assenza di Comportamento materno: fino a 2 Durata = 30 minuti N=10 FEMMINE B6/J; N=10 FEMMINE BTBR

Risultati Comportamenti diretti verso i piccoli:  Maggiore latenza di approccio ai piccoli  Ridotte frequenze di licking e nest-building  Nessuna differenza significativa in retrieving, sniffing e arched back nursing ** ***

** Comportamenti non diretti verso i piccoli: Maggiore frequenza di self-grooming stereotipato, Minore frequenza di attività di ricerca dei piccoli (Digging) Maggiore immobility Maggiore frequenza in attività

Immunofluorescenza : espressione del gene c-fos nel bulbo olfattivo e nell’area preottica ipotalamica* Marcata riduzione dell’espressione del c-fos nel bulbo olfattivo a seguito della presentazione dei piccoli; Ridotta diminuzione nell’area preottica. Deficit nel riconoscimento olfattivo ? * In collaborazione con Dr. S. Farioli-Vecchioli, Biol Cell Neurobiol CNR, Roma

Immunofluorescenza: espressione c-fos e ossitocina nel nucleo paraventricolare dell’ipotalamo Le cellule OXT-positive sono comparabili nei due ceppi, ma l'esposizione ai piccoli induce un’attivazione neuronale maggiore nelle B6/J rispetto alle BTBR. Nelle BTBR si attiva un maggior numero di neuroni ossitocinergici.

ESPERIMENTO 2: OSSERVAZIONE QUOTIDIANA DEL TEMPO TRASCORSO DENTRO O FUORI DAL NIDO IN FEMMINE ALLATTANTI

OSSERVAZIONE "IN/ OUT NEST" Le femmine BTBR trascorrono un tempo significativamente inferiore nel nido rispetto al ceppo di controllo nei primi 4 giorni dopo il parto Interazione ceppo x postpartum day p<0.01

Maternal behaviour testPotenziamento materno Separazione della nidiata per un’ora Presentazione di tre piccoli Valutazione di: Latenza allo sniffing Comportamenti diretti verso i piccoli Comportamenti autodiretti Durata = 30 minuti N= 13 BTBR N= 12 B6/J

Risultati del test di comportamento materno al 2° giorno postpartum * *** * ** Diretti verso i piccoliNon diretti verso i piccoli  Maggior durata di Snifing  Non emergono differenze significative nel livello di cure materne Minor tempo nella ricerca dei piccoli Maggior attività di esplorazione dell’ambiente

MATERNAL AGGRESSION TEST al 7° giorno postpartum: difesa del nido nei confronti di un maschio adulto Comportamenti Difensivi Attack Following Comportamenti di difesa del nido In Nest Nest-building Comportamenti sociali Aprroach Social-sniffing Mutual- Circling Comportamenti non sociali: Explore Immobility Self-grooming

Risultati

ESPERIMENTO 3: osservazione del comportamento materno all’interno della gabbia di residenza nei primi 8 giorni postpartum PPD1 PPD8 MATERNAL BEHAVIOUR OBSERVATION (Hours 09:00; 14:00; 19:00) In Nest Out Nest Arched back nursing Nursing posture Licking Contact with pups Non maternal behaviour, eating, drinking, locomotion. N= 8 B6/J N= 10 BTBR

Frequenza (Num/ min) PPD BTBR B6/J * Arched Back Nursing PPD BTBR B6/J Frequenza (Num/min) ** Nursing Frequenza (Num/min) PPD BTBR B6/J ** IN Nest ** Contact with pups ** Comportamenti diretti verso i piccoli nei primi 8 giorni dopo il parto p< 0.01 p< 0.05

Conclusioni - 1 Le femmine vergini,in assenza degli ormoni della gravidanza e del parto, effettuano risposte di cura materna impiegano un tempo maggiore ad iniziare le cure materne rispetto al ceppo di controllo. Elevata frequenza di comportamenti autodiretti Le femmine allattanti nel complesso hanno prestazioni riproduttive comparabili ai controlli ma Significativa riduzione dei comportamenti diretti verso i piccoli nei primi 5 giorni post- partum Mantengono costante il pattern parentale all’aumentare dei giorni post-partum mentre nel ceppo di controllo si osserva una naturale diminuzione all’aumentare dell’età dei piccoli Esibiscono un normale comportamento di difesa del nido

Conclusioni - 2 A. Mancata attivazione del gene c-fos nel bulbo olfattivo in seguito alla presentazione dei piccoli: Deficit nel riconoscimento di segnali olfattivi sociali? Questo potrebbe spiegare il fenotipo scarsamente sociale del ceppo BTBR? B.Minore attivazione del gene c-fos rispetto alle B6 nel PVN, sede di sintesi dell’ossitocina: Alterato signaling ossitocinergico?

I nostri dati indicano che lo stile materno nelle femmine BTBR, valutato in differenti contesti sperimentali, è caratterizzato da discontinuità dei comportamenti di cura parentale; ridotto contatto e prossimità con la nidiata; prevalenza di attività autodirette; ridotta flessibilità comportamentale.  E’ ipotizzabile che l’alterato stile materno possa amplificare il fenotipo scarsamente sociale e la suscettibilità allo stress di questo ceppo, considerato un modello animale di autismo.  I dati riguardanti l’espressione del c-fos e i livelli di ossitocina nell’ipotalamo aprono una prospettiva di studio sul ruolo di questo neuropeptide nella modulazione delle risposte sociali in questo ceppo murino.

GRAZIE PER L’ATTENZIONE RINGRAZIAMENTI Gemma Calamandrei Flavia Chiarotti Laura Ricceri Maria Luisa Scattoni Aldina Venerosi Alessia De Felice Reparto di Neuroscienze comportamentali – ISS Andrea Mele Sapienza Università di Roma Istituto di Biologia cellulare e Neurobiologia-CNR Debora Cutuli Stefano Farioli Vecchioli Fondazione Santa Lucia Istituto di Biologia cellulare e Neurobiologia-CNR