Il tumore: una visione integrata

La cellula tumorale acquisisce queste caratteristiche mediante mutazioni alterazioni epigenetiche

La resistenza delle cellule umane alla trasformazione tumorale Le nostre cellule hanno una serie di meccanismi/checkpoints formidabile per arrestare il processo di trasformazione tumorale Nelle nostre cellule si accumulano moltissime mutazioni, ma la trasformazione tumorale rimane un evento raro Singole mutazioni sono quindi insufficienti per la trasformazione tumorale: modello “multi-step” della trasformazione tumorale

I checkpoint sono una barriera fisiologica al processo di trasformazione tumorale

La senescenza cellulare è un evento comune di risposta anti-tumorale Nei: Mutazione della chinasi BRAF: Attivazione di segnali di crescita incontrollati Replication stress Attivazione di DnaDamageResponse (DDR) Senescenza cellulare (documentata in vivo nella cute umana) Quanti altri casi???

La progressione tumorale Il tumore rappresenta un’entitá dinamica nelle sue stesse fondamenta genetiche La semplice descrizione delle anomalie genetiche perció é insufficiente per farci capire come “funziona” Occorre una visione “integrata” della storia naturale del tumore, nei vari stadi della sua progressione

Teoria della selezione clonale In base a questo modello, la tumorigenesi si puó considerare come l’espansione seriale di cloni successivi di cellule, caratterizzati dall’acquisizione di mutazioni che conferiscono un vantaggio selettivo di crescita nei confronti delle popolazioni cellulari circostanti Per arrivare ad un fenotipo tumorale maligno, é necessaria una serie di alterazioni. Una sola alterazione genetica di per sé puó essere controllata da meccanismi di risposta cellulari Le alterazioni sono prevalentemente genetiche, ma alterazioni “epigenetiche” e quindi stabilmente ereditabili di pattern di espressione genica sono anch’esse importanti

Emergenza sequenziale di subcloni Emergenza sequenziale di subcloni. Un processo di selezione competitiva fra I subcloni coesistenti porta all’emergenza del subclone maligno “vincente”, che peró puó acquisire nel tempo nuove alterazioni genetiche dando origine ad eterogeneitá genetica

Progressione lineare o “caotica”? Nella visione classica, mutazioni emergono che portano via via all’emergenza di cloni con maggiore malignità Nella visione che tiene conto di alcuni risultati più recenti, più cloni (derivati da una unica cellula di origine del tumore, ma caratterizzati da eterogeneità genetica) possono coesistere contemporaneamente nella massa tumorale

Modelli di progressione tumorale Modello monoclonale Modello policlonale

I vantaggi dell’eterogeneità clonale La presenza di più cloni fornisce la capacità di esplorare il “paesaggio di fitness” (fitness landscape) con maggiore efficienza Uno dei subcloni può trovarsi in vicinanza di uno dei picchi di fitness, e quindi avvicinarsi ad esso mediante un numero di eventi mutazionali basso Dopo terapia, uno dei subcloni –ancora- può trovarsi vicino ad uno dei nuovi picchi di fitness imposti dai farmaci

A: condizioni di base B: dopo terapia

Un esempio: recidiva di leucemia Sequenziamento completo del genoma di cellule leucemiche all’esordio, e dopo la prima recidiva: uno dei subcloni diventa il clone dominante, acquisendo nuove mutazioni

Selezione clonale e cellule staminali tumorali

Patogenesi molecolare dei tumori

Mutazioni ed instabilitá genomica Alcuni numeri “agghiaccianti”: 1014 cellule/uomo; 1016 divisioni cellulari/durata della vita media; 10-6/10-7 frequenza di mutazioni/gene/divisione cellulare Ogni gene umano é mutato 10 miliardi di volte durante la nostra vita!!! La maggior parte di queste mutazioni non sono trasmissibili perché non avvengono nelle cellule germinali

Geni associati alla trasformazione neoplastica Oncogeni: l’”acceleratore” bloccato Oncosoppressori: I “freni” malfunzionanti Instabilitá genomica: guida in stato di ubriachezza

Modelli teorici di soppressione tumorale L’inattivazione di un gene il cui prodotto funge da mediatore in un pathway lineare dá come risultato l’inattivazione dell’intero pathway. In questo caso, l’inattivazione successiva di un altro componente dello stesso pathway non conferirebbe ulteriori vantaggi selettivi alla cellula che presenta la prima mutazione, e quindi la mutazione successiva non sarebbe osservabile nel tumore emergente.

Visione integrata di oncogeni ed oncosoppressori Aldilá del singolo gene, quello che occorre considerare é la necessitá per la cellula tumorale di raggiungere l’inattivazione di un determinato pathway Tale inattivazione si puó raggiungere per attivazione di un oncogene, o per inattivazione di un oncosoppressore Questa visione ci consente di classificare I geni in base al pathway cui appartengono: geni appartenenti a pathway diversi (p.es. Rb e p53) sono spesso mutati nella stessa cellula tumorale

Analisi di geni in tumori In ognuno dei tre maggiori pathway oncosoppressori, l’inattivazione di Un componente preclude l’inattivazione degli altri componenti.

Riarrangiamenti cromosomici nelle leucemie acute e nei tumori solidi Nei tumori del sistema ematopoietico, vi sono caratteristici riarrangiamenti cromosomici associati a determinati tipi di leucemie;questi riarrangiamenti sono direttamente coinvolti nella patogenesi del tumore; Nei tumori solidi, le anomalie cromosomiche sono molto piú eterogenee,e non sempre chiaramente associate alla patogenesi del tumore;

Conseguenze delle traslocazioni cromosomiche Alterazioni nel pattern di espressione Alterazioni di sequenza aminoacidica (proteine di fusione)

Amplificazione Per amplificazione genica si intende un aumento nel “copy number” (>6 copie per genoma diploide) di una specifica regione subcromosomica (1-2Mb o meno) Apparenza citogenetica: Extracromosomale, come piccoli corpi di cromatina (double-minute bodies) Integrata cromosomalmente, con la formazione di un HSR (homogeneously stained region)

Conseguenze dell’amplificazione genica Aumentati livelli di espressione di uno o piú geni Teoricamente, l’iperespressione di tali geni deve conferire un vantaggio selettivo per la crescita della cellula tumorale In pratica, I geni coinvolti sono di due tipi: Oncogeni Geni per la resistenza a determinati chemioterapici Altri geni amplificati: c-erbB2 nei tumori della mammella, cyc-D, L-myc.

Nuove informazioni sulla rilevanza dell’amplificazione genica nei tumori Costituzione di vari consorzi internazionali (> importante: TCGA) per il sequenziamento massivo di tumori Questi studi dimostrano che “copy number variation” (quindi amplificazioni-delezioni) sono il fenomeno > frequente (> mutazioni) nella maggior parte dei tumori

Quanti sono i geni mutati in un tumore ?

Next Generation Sequencing Progresso delle tecnologie di sequenziamento del DNA e riduzione dei costi sequenziamento del genoma umano (3,000,000,000 di basi) negli anni ’90-inizio 2000: >5 anni, $300,000,000 L’ALTRO IERI (2010): sequenziamento del genoma umano di J. Watson in 1-3 mesi, $350,000!!! IERI (2011): sequenziamento di 1 genoma in 1 settimana, 50,000$ OGGI: 1-10,000 genomi/anno DOMANI: 1 genoma in 4..... MINUTI per < $1,000!!!

How was this achieved? Integration (Think about sequencing pipeline) Parallelization Miniaturization Same concepts that revolutionarized integrated circuits

Massively parallel sequencing Sequenziamento tradizionale: regioni di DNA vengono isolate, clonate in plasmidi (o simili), amplificate mediante crescita in batteri e quindi cloni individuali vengono sequenziati Sequenziamento parallelo: il DNA da analizzare viene frammentato e (senza essere clonato) viene immobilizzato su una superficie solida (un vetrino, p.es.), quindi viene amplificato via PCR e poi ogni singolo frammento viene sequenziato contemporaneamente

Sequenziamento sistematico del DNA dei tumori Prima analisi completata nel 2007: circa 20 tumori (colon e mammari) Sequenziamento degli esoni trascritti (non dell’intero genoma) per circa 20,000 geni dal tessuto normale e dal tumore Geni mutati nel tumore rianalizzati in altri 25 pazienti per avere una idea della frequenza di mutazioni riscontrate per quel gene nei tumori I più interessanti sono sequenziati in altri 100 pazienti

Alcuni conti Identificate in media ≈ 80 mutazioni/tumore Le mutazioni interessano geni diversi in tumori di tipo diverso (colon vs mammari)

Il paesaggio “mutazionale” dei tumori

Considerazioni Pochissimi sono i geni mutati frequentemente in molti tumori (5): “MONTAGNE” La maggior parte dei geni identificati sono mutati raramente in alcuni tumori: “COLLINE”

Due tumori del colon: praticamente due diverse malattie

Chi conta di più? Le ricerche si sono concentrate in passato sulle “montagne”, che sono state scoperte prima con le tecnologie disponibili In realtà le “colline” rappresentano la situazione più frequente Le “colline” sono molto numerose, ma il numero di “pathways” colpito è minore (più colline appartengono allo stesso pathway)

Il primo tumore umano interamente sequenziato AML con cariotipo normale (100,000,000,000bp sequenziate!!!)

Variazioni o mutazioni? Mutazioni “driver” (che portano a variazioni funzionali importanti per il fenotipo tumorale) vs mutazioni “passenger” (neutrali, dovute all’instabilità del genoma delle cellule tumorali)

La progressione tumorale “da vicino” Sequenziamento di tumori primari/mestastasi dallo stesso paziente

Mutazioni in tumori pancreatici metastatici Due tipi di mutazioni Founder (presenti sia nel tumore primario che in tutte le metastasi) Progressor (presenti solo in una o più metastasi)

La geografia della progressione tumorale Le cellule che danno inizio a metastasi hanno già accumulato le mutazioni “progressor” nel tumore primario Diverse cellule (con diverso spettro di mutazioni progressor) danno origine a diverse metastasi

Il sequenziamento di diverse regioni del tumore/metastasi rivela uno spettro di mutazioni: comuni a tutte le lesioni tumorali, comuni solo al tumore primario, comuni solo alle metastasi, “uniche” per ciascuna regione sequenziata.