POLIMERASE CHAIN REACTION (PCR) -E’ UNA PROCEDURA PER OTTENERE IN GRANDE QUANTITA’ UNA SPECIFICA SEQUENZA DI DNA IN VITRO -QUESTA TECNICA PUO’ AMPLIFICARE UN TRATTO DI DNA PER PIU’ DI UN MILIONE DI VOLTE

ELEMENTI NECESSARI ALLA REAZIONE: 1- DUE OLIGONUCLEOTIDI COMPLEMENTARI A DUE REGIONI CHE SI TROVANO SU FILAMENTI OPPOSTI DEL DNA STAMPO AI LATI DELLA REGIONE CHE SI VUOLE AMPLIFICARE 2- DNA STAMPO CHE CONTENGA LA REGIONE DA AMPLIFICARE 3- POLIMERASI TERMOSTABILE (NON VIENE DENATURATA SE PORTATA A 95° C) 4- I 4 DESOSSINUCLEOTIDI TRIFOSFATI

PROCESSO DI PCR PREVEDE UN CERTO NUMERO DI CICLI. OGNI CICLO CONSISTE DI 3 PASSAGGI: 1- DENATURAZIONE: TEMP. 95°C. IL DNA STAMPO VIENE DENATURATO 2-APPAIAMENTO: 55°C CIRCA. I PRIMERS SI APPAIANO CON IL DNA STAMPO 3- SINTESI: TEMP.72°C E’ OTTIMALE PER IL FUNZIONAMENTO DI Taq (Termus aquaticus) POLIMERASI

PCR

PCR VANTAGGI: Sensibilita’ Rapidita’ Si presta all’analisi simultanea di molti campioni (high throughput) Si presta all’analisi simultanea di diverse sequenze sullo stesso campione Si presta all’analisi di DNA degradato o incluso in mezzi strani, o fissato SVANTAGGI: Sensibilita’ (rischio di contaminazioni-falsi positivi) Variabile efficienza di amplificazione a seconda della sequenza Richiede conoscenza di base delle sequenze da amplificare e messa a punto per coppie di oligonucleotidi di innesco (primers) Può sintetizzare frammenti relativamente corti La sintesi è imprecisa e introduce errori nella sequenza(la Taq pol non possiede attività 3’->5’ esonucleasica)

Cella elettroforetica per gel di agarosio

Separazione di frammenti di DNA (o RNA) di diversa lunghezza tramite elettroforesi

- + DNA genomico RNA totale mRNA M E6 E4 28S 18S DNA satellite 7S 10 9 5 4 3 18S 2 DNA satellite 1 7S +

Segmenti lunghi fino a qualche centinaio di chilobasi DNA satellite Unità da 5 a 200 bp. Segmenti lunghi fino a qualche centinaio di chilobasi

Trasferimento secondo Southern (Southern blot)

SOUTHERN BLOT

Altra forma di ibridazione su membrana: il dot blot (sia con campioni di RNA che di DNA) 1 1 2 3 4 2 5 6 7 8 3 9 10 11 12 4 13 14 15 16 Dot blot

Polimorfismi del DNA: SNP (single nucleotide polymorfism) ---ATGTTGAAGTTCAAGAATTCTGTGCGGAAC--- ---ATGTTGAAGTTCAAGTATTCTGTGCGGAAC--- ---ATGTTGAAGTTCAAGCATTCTGTGCGGAAC--- ---ATGTTGAAGTTCAAGGATTCTGTGCGGAAC---

Polimorfismi del DNA: microsatelliti Minisatelliti Unità fino a 5 bp. Segmenti lunghi fino a 25 kb Allele A TACCAAGGTACGGACGGACGGACGGGGTACCATGG Allele B TACCAAGGTACGGACGGACGGACGGACGGGGTACCATGG Microsatelliti Unità < 4bp. Segmenti lunghi fino150 bp Allele A TACCAAGGTACACACACGGTACCATGG Allele B TACCAAGGTACACACACACGGTACCATGG Allele C TACCAAGGTACACACACACACGGTACCATGG Allele D TACCAAGGTACACACACACACACGGTACCATGG

Come evidenziare i polimorfismi? RFLP= restriction fragment length polymorphism

Gli RFLP possono evidenziare sia polimorfismi dovuti a mutazione di singoli nucleotidi sia polimorfismi di tipo minisatellite (VNTR = Variable Number of Tandem Repeats)

I polimorfismi di tipo microsatellite possono essere evidenziati mediante PCR (STRP = Short Tandem Repeat Polymorphisms)

Applicazioni di Southern e PCR

Mappatura del genoma umano

Indagini di medicina forense Quando il materiale biologico è troppo scarso o di qualità scadente, può essere utile analizzare i polimorfismi del DNA mitocondriale (moltissime copie per cellula)

Diagnosi di mutazioni concatenate con marcatori RFLP A volte la mutazione patogena può abolire o creare un sito di restrizione

A volte la mutazione patogena può abolire o creare un sito di restrizione specifico

L’utilizzo combinato della PCR e dell’analisi di restrizione permette di diagnosticare specifiche mutazioni molto più facilmente che con il Southern Blot

Diagnosi di mutazioni mediante dot-blot e ibridazione con oligonucleotidi allele-specifici b A b S P1 P1 P2 P2 PCR

Diagnosi di mutazioni mediante dot-blot e ibridazione con oligonucleotidi allele-specifici

Diagnosi di mutazioni mediante amplificazione allele-specifica

Diagnosi di mutazioni mediante amplificazione (di DNA genomico o cDNA) e sequenziamento diretto.

L’utilizzo simultaneo della PCR e di traccianti fluorescenti consente l’analisi simultanea (multiplex) di moltissimi polimoprfismi

Diagnosi genetica pre-impianto

Diagnosi genetica pre-impianto

Diagnosi genetica pre-impianto Quali i vantaggi, e quali i pericoli? Possibile già oggi per malattie monogeniche per cui sia nota la mutazione In futuro, almeno in teoria, è probabile che questa tecnica, in combinazione con l’analisi simultanea di moltissimi polimorfismi, possa permettere una valutazione di tratti genetici complessi. Quali i vantaggi, e quali i pericoli?

La PCR può essere usata per misurare l’espressione genica: RT-PCR Estrazione di mRNA Sintesi del cDNA utilizzando trascrittasi inversa (priming possibile con oligo-dT, oligo random o primer specifico) Amplificazione con oligonucleotidi specifici Elettroforesi su gel di agarosio

Caratteristiche dell’RT-PCR E’ in assoluto la tecnica più sensibile, in quanto utilizza la PCR. Non richiede purificazione dell’mRNA Richiede pochissimo RNA di partenza (si può partire da qualche decina di cellule) Semplice e rapida Funziona anche su RNA parzialmente degradato Non da informazioni sul peso molecolare dell’mRNA Non è quantitativa a meno di non usare particolari accorgimenti

Real time PCR Real Time PCR Recentemente è stata sviluppata una nuova metodica: la Real Time PCR. Questa consente di seguire la cinetica di reazione nel tempo ed è quindi estremamente quantitativa.