COS’E’ IL PROTEOMA? “PROTEins expressed in a functional genOMA” relazione con lo spazio relazione con il tempo

STRUMENTI PER LO STUDIO DEL PROTEOMA Elettroforesi bidimensionale (2-DE) Analisi di immagine (scanner) Spettrometria di massa ( MALDI- TOF; ESI) Ricerca in database on line Microsequenziamento

2-DE (Elettroforesi bidimensionale) Una tecnica “vecchia” di 30 anni (1970) Perche solo ora? Combinazione di SDS-PAGE e IEF

2-DE (Elettroforesi bidimensionale) “Prima dimensione”: IEF Separazione per pI (punto isoelettrico) “Seconda dimensione”: SDS-PAGE separazione per massa molecolare Prima

IEF (isoelettrofocalizzazione) Separazione su gradiente di pH delle proteine Migrazione che si arresta al pI Dalle “anfoline” alle “immobiline” le “strips”

IEF ( strips e gradiente) facilmente manipolabili Gradiente dalle anfoline alle immobiline

SDS - PAGE Elettroforesi denaturante su gel di p-acrilammide sodio dodecil solfato (SDS) Separazione secondo la massa tutte le proteine sono cariche negativamente

MAPPA PROTEICA pH 4-9 STRIP -1D SDS-PAGE - 2D

MAPPA PROTEICA Xilema di eucalipto STRIP -1D SDS-PAGE - 2D

Colorazioni Metodi freddi Metodi caldi silver staining comassie blue (colloidale) ponceau red Fluorescenza (2,4- difenilossazolo) Ab e chemioluminescenza Metodi caldi 35S, 14C, 3H, 32P

Trasferimento su membrana Western blot (elettroblotting) supporto maneggevole conservazione isolamento di spots proteici

Acquisizione e analisi dell’immagine

Il “decollo” del PROTEOMA Spettrometria MALDI- TOF Spettrometria ESI Microsequenziamento

Digestione in gel Lo spot proteico viene decolorato frammentato in peptidi cristallizzato su una matrice solida

Spettrometria di massa In un tubo sotto vuoto applicando una ddp. si formano elettroni e radiazioni positive (J.J. Thompson, inizio 900) Spettrometro di massa: Separa ioni in fase gassosa per rapporto carica/massa strumento analitico che misura la massa molecolare di uno ione (PEPTIDE)

Spettrometria di massa Separazione di ioni in fase gassosa secondo il rapporto carica/massa Fasi dell’analisi introduzione del campione ionizzazione (MALDI o ESI) separazione (TOF o ION-TRAP) rivelazione elaborazione

Sorgente: MALDI Sorgente: La proteina cristallizzata è: Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization La proteina cristallizzata è: colpita dal LASER evapora ionizza per protonazione spettri semolici (monocarica)

Analizzatore TOF Tubo di lunghezza definita sotto vuoto assenza di campo elettrico I peptidi vengono accelerati e “spiccano” il volo Ec=mv2/2 molecole piccole…balzi grandi molecole grosse…balzi piccoli 5 attomoli /ul masse da 500 Da a 150 KD

Sorgente: ESI Ionizzazione per elettronebulizzazione particelle liquide cariche da cui gli ioni vengono emessi per desolvatazione ioni multicarica spettri complessi

Analizzatore ION-TRAP Analizzatore a quadrupolo (“filtro ionico”) Ion trap: quadrupolo tridimensionale elevata sensibilità elevata risoluzione selezione di uni ione (MS/MS) Frammentazione di un peptide

Banche dati Dallo spettrometro si ottengono NUMERI!! Rapporti carica/massa Questi valori (spettri) vengono inseriti in database: EMBL (Europe) GenBank (USA) SWISS PROT

Banche dati : Tipi di identificazione Peptide mass fingerprinting masse ottenute vs masse virtuali di peptidi ottenuti “in silico” dele proteine presenti nel database Peptide fragment ion search massa ottenuta tramite MS/MS vs tutte le masse virtuali generabili dal database proteico Peptide sequence tag sequenza desunto da MS/MS vs i frammenti generati “in silico” dal database

Banche dati : Tipi di identificazione FASTA BLAST

Microsequenziamento Chimica di EDMAN Non rientra propriamente nel Progetto Proteoma Di grande aiuto per la correlazione con sequenze geniche

CONCLUSIONI SEPARAZIONE SISTEMATICA di PROTEINE IDENTIFICAZIONE QUANTIFICAZIONE Diff. CELLULARE, MARCATORI per MALATTIE, NEW DRUGS SOSTANZIALE EQUIVALENZA