Percorso multimediale Il seguente documento illustra le tecniche per il rilievo ed il conteggio di indici microbiologici in acque minerali con la tecnica delle membrane filtranti. Le analisi sono condotte sia utilizzando terreni tradizionali che con l’impiego dei più recenti mezzi cromo-fluorogenici (one step).

Le ricerche descritte riguardano i seguenti parametri E Le ricerche descritte riguardano i seguenti parametri E. Coli Enterococchi intestinali

E. Coli tecnica two steps Parte prima E. Coli tecnica two steps

Dinamiche di crescita – AT7+TTC Clicca per avviare l’animazione > 48 ore 24 ore 16 ore

Quale tradizionale terreno two steps è raffigurato nella foto? AT7+TTC m-FC

NO Questo è m-FC

Isolamento su AT7+TTC Indica le colonie target Non target TTC positiva Non target TTC positiva OK!!! Non target parziale inibizione Non target TTC negativa target target target

Il target in uscita è “coliformi fecali”. AT7+TTC è un tradizionale terreno two steps, rileva fermentazione lattosio associata a termotolleranza. Il target in uscita è “coliformi fecali”. La normativa impone il rilievo di E. coli, quindi saranno necessarie prove di conferma

Procediamo che cosa prevede la prossima fase? Clicca sull'immagine giusta Trapianto in BBVBL con incubazione a 37/44°C Semina in Mac Conkey agar NO OK

Clicca sull'immagine giusta Il percorso di conferma adesso prevede: Sottocoltura in MCA Test biochimici NO OK

Nella prossima slide dovrai selezionare i test differenziali corretti

Test di conferma E. coli Test differenziali Seleziona dal seguente elenco i test necessari Indolo OK!!! Catalasi Non necessario Ossidasi (negativo) OK!!! Ornitina decarbossilasi OK!!! Solfuro (positivo) NO!!! Solfuro (negativo) OK!!!

Ornitina decarbossilasi Test differenziali SIM Ornitina decarbossilasi

Test differenziali Codifica numerica ENTEROTUBE II

E. Coli e coliformi totali Tecnica one step procedi

I terreni one step per E. coli e coliformi totali La foto mostra 2 colonie target b-GUD positive, e numerose colonie b-GAL positive quale terreno è rappresentato in figura? Chromatic DETECTION NO, su questo terreno non è rilevata la b-GUD ECX-GLUC NO questo terreno non rileva la b-GAL TBX NO questo terreno non rileva la b-GAL Chromagar ECC OK!!!

Dettagli Chromagar ECC selezionare le proprietà differenziali Contiene un b-glucuronide (detector per b-GUD) OK!!! Contiene un b-galattoside (detector per b-GAL) OK!!! Fermentazione lattosio NO!!! selettive Violetto etile NO!!! Nella versione standard non è selettivo OK!!! Sali biliari n°3 NO!!!

I terreni one step per E. coli e coliformi totali Clicca sul pulsante, visualizza le foto a luce naturale ed UV che mostrano 3 colonie target b-GAL positive e b-GUD positive, di quale terreno fluoro-cromogenico si tratta? Luce naturale/UV Chromagar ECC NO, su questo terreno i b-GUD sviluppano colonie blu-verde ed i b-GAL colonie color malva ECX-GLUC NO questo terreno non rileva la b-GAL C-EC agar OK!!! TBX NO questo terreno non rileva la b-GAL

I terreni one step per E. coli La foto mostra 2 colonie target b-GUD positive, quale terreno è rappresentato in figura? Chromagar ORIENTATION NO, questo terreno non rileva la b-GUD M-FC NO, terreno two steps TBX OK!!!

I terreni one step per E. coli ECX-Gluc La foto mostra varie colonie target, rispondi alle domande Quale attività enzimatica evidenziano? Sono b-GUD positive Quale colore mostrano le colonie target? Blu-verde Questo terreno permette di rilevare tutti gli E. coli? No, solo quelli tipici (b-GUD positivi) 94-97%

Conferme dirette INDOLO diretto su C-EC agar INDOLO su tradizionale TW (in alto) e su ECX-Gluc (a dx) Visibile a sx il test eseguito su TBX (caratteristica non specifica per questo terreno)

Enterococchi intestinali tecnica two steps Parte seconda Enterococchi intestinali tecnica two steps

Quale tradizionale terreno two steps è raffigurato nella foto Quale tradizionale terreno two steps è raffigurato nella foto? Clicca sul tag giusto S&B KF BEA

NO Questo è S&B

NO Questo è BEA

Isolamento su KF Identifica le colonie target e non target OK!!! TARGET TARGET TARGET NON TARGET NON TARGET NON TARGET NON TARGET

Isolamento su KF Indicare le colonie target NON TARGET SUGGERIMENTO Le colonie gialle con centro arancio mostrano minore capacità di ridurre il TTC, tuttavia devono essere ritenute target

Dettagli KF selezionare le proprietà differenziali Bile NO!!! Riduzione TTC OK!!! Fermentazione maltosio OK!!! selettive Sodio azide OK!!! Esculina NO!!! b-Glucuronidasi NO!!!

Conferme su BEA Conferma in piastra

Esempio di conferma diretta Questo è BEA L’idrolisi dell’esculina è resa evidente mediante l’annerimento mostrato sul retro della piastra. Clicca sul pulsante per alternare la vista fronte /retro Fronte/retro

Conferma diretta altro esempio

Dettagli BEA selezionare le proprietà selettive Sodio azide OK!!! Riduzione TTC NO!!! Fermentazione maltosio NO!!! Bile 40% OK!!! Idrolisi esculina NO!!! b-GAL NO!!!

Dettagli BEA selezionare le proprietà differenziali Fermentazione maltosio NO!!! Bile 40% NO!!! b-GAL NO!!! Idrolisi esculina OK!!! Fermentazione lattosio NO!!! Riduzione TTC NO!!!

Il percorso di conferma adesso prevede: Clicca sull'immagine giusta Test fisiologici Test sierologici NO OK

Test di conferma Enterococchi Seleziona dal seguente elenco i test necessari Motilità SBAGLIATO Catalasi OK!!! Ossidasi SBAGLIATO Toll. 40% bile OK!!! Alotolleranza (BHI NaCl 6,5%) OK!!! Crescita a 45°C OK!!!

Alotolleranza (BHI NaCl 6,5%) Termoresistenza (BHI a 45°C 24/48 h PYR Alotolleranza (BHI NaCl 6,5%) Termoresistenza (BHI a 45°C 24/48 h

Enterococchi intestinali Tecnica one step procedi

E.C.O.A.GAR Enterococcus chromogenic Ottaviani & Agosti

E.C.O.A.GAR Enterococcus chromogenic Ottaviani & Agosti La foto mostra varie tipologie di colonie, individua quelle target Rosa-rosso NO Bianco-grigio NO Turchese-azzurro OK!!!

Percorsi didattici alternativi Il rilievo dei target E. coli, coliformi totali ed enterococchi intestinali può essere eseguito anche con altri terreni di ultima generazione. Tali mezzi, sebbene progettati per rilevare gli UTI (gli organismi responsabili di infezioni del tratto genito-urinario), sono utilizzati a scopo didattico per ricercare i suddetti target anche in matrici alimentari e nelle acque. Chromagar orientation Chromatic detection

Chromagar orientation La foto mostra colonie target di E. coli, coliformi totali ed enterococchi intestinali. Individua le varie tipologie e verifica la tua risposta cliccando sui pulsanti corrispondenti E. coli Colonie rosa-rosso magenta Enterococchi Colonie turchese Coliformi totali Blu-blu metallico Altri Bianco-giallo

Chromagar orientation Individua le colonie target Enterococchi Enterococchi Coliformi totali Coliformi totali E. coli Coliformi totali

Chromatic detection Clicca sulle immagini per una descrizione Coliformi totali (in blu) e non target (bianche) Mix E. coli e coliformi totali Enterococchi

Chromatic detection dettagli

Grazie e buon lavoro Tutti i contenuti inclusi nella presentazione sono stati prodotti ed elaborati presso ITIS “G. Galilei “ Livorno dai docenti del gruppo disciplinare di biologia con il supporti degli studenti delle classi quinte BIO 2011