Batteri anaerobi

Definizione Batteri incapaci di crescere sulla superficie di un terreno solido adatto, incubato in atmosfera ambiente o in incubatore a CO2 I batteri anaerobi di interesse clinico ricevono energia da processi fermentativi in cui i composti organici come gli acidi, gli alcoli ed altri composti servono da accettori finali di elettroni

Anaerobi obbligati Stretti: non tollerano concentrazioni di O2 >0,5%; l’esposizione all’aria per 10 min ne determina la morte. Sono rari nelle infezioni umane. Fanno parte della componente batterica normale dell’uomo (es. Clostridium haemolitycum, Treponema denticola, Peptostreptococcus spp., Peptococcus spp.) Moderati: tollerano concentrazioni di O2 dal 2 all’8% (in media il 3%) e piu’ di 10 min di esposizione all’aria. Sono comuni nelle infezioni umane (es: Bacteroides fragilis, Prevotella spp, Porphyromonas spp, Fusobacterium nucleatum, Clostridium perfrigens) Anaerobi aerotolleranti Crescono bene in anaerobiosi ma anche se vengono incubati in atmosfera ambiente o con il 5-10% di CO2 (crescita scarsa) Microaerofili Necessitano di O2 come accettore finale di elettroni. Non crescono a concentrazioni di O2 >21%. La miscela ottimale per la loro crescita e’: 5% di O2, 10% di CO2, 85% di N2 (Campylobacter jejuni) Anaerobi facoltativi In aerobiosi → l’accettore finale di elettroni e’ l’O2; in anaerobiosi → reaz. di fermentazione

Tolleranza all’ossigeno Sembra che la diversa tolleranza all’ossigeno dipenda da diversi fattori: velocità con cui le cellule batteriche captano O2; velocità con cui differenti batteri elaborano prodotti tossici dall’O2 (radicali idrossilici liberi: OH- e superossidi: O2-); produzione di catalasi, perossidasi, superossido dismutasi, vari enzimi che proteggono i batteri dai prodotti tossici dell’O2. E’ importante l’impiego di grandi inoculi batterici che diminuiscono l’effetto tossico dell’O2

Batteri anaerobi presenti nella normale flora umana Cavità orale e vie aeree superiori Porphyromonas spp., Prevotella spp. (P. oralis), Bacteroides (B . ureolyticus), Fusobacterium (F. nucleatum), Peptostreptococcus spp., Veillonella spp., Tannerella spp., Actinomyces spp., Propionibacterium spp. Stomaco Lattobacilli Intestino tenue Streptococchi, lattobacilli Intestino crasso Bacteroides fragilis, Porphyromonas spp., Fusobacterium spp., Clostridium spp., Eubacterium spp. Bifidobacterium spp., Propionibacterium spp., Cocchi anaerobi Tratto genitourinario, vagina e cervice Prevotella spp., Porphyromonas spp., Bacteroides spp., Peptostretocccus spp., Clostridium spp., Veilonella spp., Latobacillus spp., Eubacterium spp., Propionibacterium spp. Uretra Propionibacterium spp., Peptostreptococcus spp., Bacteroides spp., Fusobacterium spp., Pelle Propionibacterium spp., Peptostreptococcus spp.

Infezione da anaerobi di origine esogena Botulismo da alimenti Botulismo neonatale Clostridium botulinum Botulismo da ferite Gastroenteriti Clostridium perfrigens Gangrena gassosa Clostridi Tetano Clostridium tetani Cellulite crepitante C. perfrigens, Bacteroides, Peptostreptococcus Infezioni superficiali benigne Infezioni a seguito di morsi da animali o da uomo Bacteroides, Peptococcus, Peptostreptococcus, Fusobacterium Aborto settico

Infezioni da anaerobi di origine endogena Ascessi a qualsiasi organo Diarree e coliti associate a terapia antibiotica Polmoniti da aspirazione Complicazioni di appendiciti e colecistiti Celluliti crepitanti e non Mionecrosi da clostridi Infezioni dentali e parodontali Endocarditi Meningiti in seguito ad ascessi cerebrali Polmoniti necrotizzanti Osteomieliti Otiti medie Peritoniti Artriti settiche Sinusiti

Materiale patologico Tamponi faringei o nasali Tamponi gengivali Escreato o materiale da broncoscopia Succo gastrico, succo duodenale, feci, tamponi rettali, fistole colon-cutanee, colonstomie (con questi materiali si può fare diagnosi di botulismo e di colite sostenute da C. difficile) Superfici di ulcere da decubito, tamponi effettuati su pareti di ascessi o da lesioni mucose Campioni diversi dai precedenti, prelevati da cute o membrane mucose senza una adeguata disinfezione Urine Tamponi vaginali o cervicali

Isolamento di batteri anaerobi da materiale patologico E’ necessario curare con attenzione alcuni passaggi: Selezione: liquidi organici non urinari, essudati da ascessi profondi, aspirati transtracheali o polmonari, biopsie di tessuti Prelievo: Preferire l’uso di aghi e siringhe, evitare l’uso di tamponi, decontaminare la superficie per i campioni da mucosa o da cute, emocolture Trasporto: Proteggere i campioni dall’esposizione all’ossigeno ed inviare al più presto i campioni al laboratorio

Isolamento di batteri anaerobi Sistemi in anaerobiosi per la coltivazione dei batteri anaerobi: Giara: viene rimosso l’O2 dal contenitore mediante reazione con l’H2 aggiunto al sistema in presenza di un catalizzatore. 2 H2 + O2 catalizzatore 2H2O Le condizioni anaerobiche vengono determinate: mediante un generatore di H2/CO2 (in busta) mediante svuotamento/sostituzione con miscela (85% N2, 10%H2, 5% CO2) L’indicatore del potenziale redox è il blu di metilene (ambiente ridotto: bianco) Come catalizzatori sono usati granuli di allumina Cappe per anaerobi: Sistema sigillato dotato di aperture con guanti che permette di eseguire le operazioni di isolamento ed identificazione al di fuori dal contatto con l’aria, che viene sostituita con N2 o da una miscela di N2/H2/CO2

Incubazione delle colture Temperatura: 35-37°C Tempo di incubazione: almeno 48 ore, preferibilmente 72-96 ore e oltre. Actinomyces e Eubacterium spp: crescono lentamente e muoiono se le piastre vengono aperte prima. Se si sospettano necrosi sostenute da Clostridi bastano 6-12 ore di incubazione

Caratterizzazione dei batteri anaerobi Comportamento all’ossigeno Caratteristiche delle colonie: colore (eventuale pigmento), densità, consistenza. Dimensioni delle colonie Pigmento Emolisi Erosione del terreno Colorazione di Gram Aspetto microscopico Spore Motilità Crescita in terreno liquido Esami biochimici Prodotti metabolici (gas cromatografia) Sensibilità agli antibiotici Esami sierologici Tossicità, neutralizzazione della tossina, patogenicità negli animali Elettroforesi delle proteine solubili

Isolamento di batteri anaerobi Esame diretto dei materiali patologici Caratteristiche della presenza di anaerobi Odore sgradevole Aspetto purulento dei campioni liquidi Presenza di tessuto necrotico, gas Esame microscopico Colorazione di Gram Test immunologici (per la ricerca diretta di antigeni di batteri anaerobi) Immunofluorescenza diretta (anticorpi specifici coniugati con fluoresceina) Difetti: bassa specificità falsi positivi bassa sensibilità falsi negativi reazioni crociate Sieroneutralizzazione (antisieri specifici in grado di inibire la citotossina di C. difficile) CDT latex agglutination = reazione con glutammato deidrogenasi di C. difficile) Sistemi immunoenzimatici = in grado di evidenziare in C. difficile: la tossina A (enterotossina) la tossina B (citotossina) Marker dell’antigammaglobulina: enzima che reagisce con numerose molecole di substrato reazione colorimetrica Gas cromatografia (GLC) Ricerca anaerobi in essudati e liquidi biologici; valida se associata ad un esame microscopico diretto del campione. Es.: Fusobacterium es. microsc. = bacilli Gram – GLC = grandi quantità di acido butirrico Es.: Bacteroides es. microsc. = bacilli Gram – GLC = grandi quantità di acido succinico

Terreni di isolamento Agar sangue: Trypticase soy agar (L-cisteina, estratto di lievito) Vitamina K1, 5% di sangue. Terreno non selettivo L’aggiunta di L-cisteina permette la crescita di batteri che necessitano di aminoacidi con zolfo, come Fusobacterium necroforum o streptococchi tiolo-dipendenti. Agar sangue + Kanamicina + Vancomicina: Isolamento selettivo di bacilli anaerobi Gram-negativi Terreno al tioglicolato arricchito con emina e Vit. K1: è un brodo di arricchimento che può essere utilizzato per arricchire i terreni solidi se il campione è particolarmente scarso. E’ consigliabile, prima dell’uso, tenere le piastre 4-6 ore in un contenitore per anaerobiosi o in atmosfera anaerobica

Microsistemi pronti all’uso API 20A e Minitek: 24H di incubazione. Lettura mediante indice analitico basato su profili numerici. Limiti: Incapacità di identificare cocchi anaerobi e bacilli anaerobi Gram-positivi asporigeni; numero insufficiente di test differenziali per la caratterizzazione e l’identificazione di batteri anaerobi asaccarolitici. Kit Rapidi (4h di incubazione in aerobiosi) Si basa sull’inoculo di substrati particolari con sospensioni dense per rilevare “enzimi preformativi” (ADS-RapID ANA II System, ATB 32A) Reazioni utili non determinabili con questi sistemi: tolleranza all’ossigeno, aspetto delle colonie, reazioni su agar-sangue, colorazione di Gram, caratteristiche morfologiche, aspetto in terreno liquido, attività lipasica e lecitinasica su tuorlo, crescita in presenza di bile, riduzione di nitrati.

Determinazione dei prodotti metabolici mediante gas cromatografia Si basa sulla identificazione dei batteri anaerobi e di numerosi aerobi facoltativi mediante la determinazione dei prodotti metabolici riversati da questi batteri nei terreni liquidi durante la crescita anaerobica. Vantaggi : - velocità di identificazione accuratezza di identificazione poco costo facile esecuzione La definizione dei generi batterici in base alle vie metaboliche ha acquistato credito scientifico perché le vie metaboliche rappresentano dei caratteri geneticamente stabili e conservati. Numerosi batteri vengono definiti sulla base di un unico prodotto metabolico: es: Propionibacterium Ac. propionico Clostridium butyrricum Ac. butirrico + CO2 +H2

Bacilli anaerobi Gram-negativi asporigeni In passato circa 50 specie venivano classificate nel genere Bacteroides. Attualmente vengono classificati i seguenti generi: Porphyromonas bacilli pigmentati non fermentanti il saccarosio, non idrolizzano l’esculina, non sensibili ai sali biliari. Prevotella bacilli sia pigmentati che non pigmentati, fermentanti il saccarosio, sensibili ai sali biliari, idrolisi all’esculina +/- in relazione alla specie. Bacteroides bacilli pleomorfi, fermentanti il saccarosio (produzione di ac. acetico e ac. succinico) resistenti ai sali biliari, idrolizzano l’esculina. Sono presenti 8 generi, di cui 50 specie colonizzano il corpo umano: cavo orale, intestino, uretra, apparato genitale. Tannerella forsythia bacilli immobili, pleiomorfi a lenta crescita (più di 14 giorni) favorita dalla presenza di acido N-acetilmuramico o di Fusobacterium nucleatum. A localizzazione sopra- e sottogengivale il cui isolamento è strettamente correlato alla profondità della tasca. Responsabile di parodontite nell’uomo e negli animali induce morte cellulare per apoptosi. Invade le cellule epiteliali. L’endotossina e la produzione di acidi grassi sono considerati fattori di virulenza. Altri solo occasionalmente possono essere patogeni per l’uomo come Campylobacter rectus (parodontopatie)

Sindromi cliniche Parodontopatie: Prevotella, Tannerella, Porphyromonas, Fusobacterium Infezioni respiratorie: Fusobacterium, Prevotella, Porphyromonas, Bacteroides non fragilis Ascessi cerebrali: Fusobacterium, Prevotella, Porphyromonas (spesso polimicrobici: cocchi aerobi + Peptostreptococcus) Infezioni intra-addominali: B. fragilis, Fusobacterium (spesso polimicrobici: cocchi aerobi + Peptostreptococcus) Infezioni della pelle e dei tessuti molli: B. fragilis Batteriemie (5% anaerobi): B. fragilis, Fusobacterium Infezioni genitali: B. fragilis Terapia e profilassi Terapia antibiotica combinata con l’intervento chirurgico. Molti ceppi sono produttori di beta-lattamasi che li rendono resistenti a penicilline e cefalosporine. La resistenza alla clindamicina è sempre più frequente tra i Bacteroides, per i quali l’antibiotico d’elezione è il metronidazolo. Visto che questi batteri fanno parte della normale componente microbica è impossibile controllare la malattia, ma se vengono danneggiate le barriere intorno alle superfici mucose è indicato un trattamento profilattico.

Gruppo Bacteroides Caratteristiche microscopiche Bastoncelli Gram-negativi con estremità arrotondate Le cellule provenienti da brodocolture possono essere pleomorfe con vacuoli Immobili Molti ceppi sono capsulati Caratteristiche colturali Morfologia delle colonie: 1-4 mm di diametro, non emolitiche, grigie, semiopache, a margini interi, spesso con strutture ad anello in superficie Resistenza: penicillina, kanamicina Sensibilità: rifampicina Saccarolitici: i pattern di fermentazione dei carboidrati, insieme all’indolo, permettono la distinzione tra le specie Resistenza ai sali biliari

Bacilli anaerobi Gram-negativi pigmentati Porphyromonas ssp(12 specie) Le specie responsabili di infezioni nell’uomo sono: P. gingivalis e P. endontalis cavo orale parodontopatie P. asaccharolitica altri siti ascessi cerebrali, infezioni urogenitali Sono tutte e tre pigmentate, asaccarolitiche, catalasi negative Le altre specie non hanno importanza clinica nell’uomo ma alcune isolate dalla cavità orale di alcuni animali (P. canoris, P. circumdentaria, P. macacae) possono causare infezioni in ferite da morsi da animale. Caratteristiche microscopiche: coccobacilli o corti bastoncelli Gram- Caratteristiche colturali: (agar sangue per anaerobi) -Pigmentazione: da giallo-marrone a nere dopo 3-5 giorni di incubazione -Fluorescenza: rosso-mattone (U.V. a onda lunga = 365nm) -Resistenza: kanamicina -Sensibilità: rifampicina, penicillina se non producono beta-lattamasi -produzione di indolo -asaccarolitici Colorazione di Gram Colonie di P. gingivalis su agar AS

Meccanismi patogenetici di P. gingivalis Meccanismi di adesione P. gingivalis mostra la capacità di interagire e legarsi a tutti i componenti della cavità orale: altri batteri, componenti salivari e proteine della matrice extracellulare. I componenti che mediano l’adesione di P. gingivalis sono fimbrie, proteasi e vescicole. Meccanismi di internalizzazione L’internalizzazione di P. gingivalis nelle cellule epiteliali è correlata con la presenza della fimbria maggiore. P. gingivalis si lega, ed inizia ad essere circondata dai microvilli della cellula ospite, e l’internalizzazione avviene per endocitosi mediata da recettori.

Bacilli anaerobi Gram-negativi pigmentati Prevotella Le specie responsabili di infezione nell’uomo sono: P. melaninogenica, P. corporis (B. melaninogenicus sub. intermedius), P. denticola, P. intermedia, P. nigrescens Queste, isolate dal cavo orale, possono causare: - infezioni delle basse vie respiratorie infezioni urogenitali Parodontopatie ascessi cerebrali (raramente) Caratteristiche microscopiche: Corti bastoncelli Gram- negativi Caratteristiche colturali: -Pigmentazione: tardiva (da 2 giorni a 3 settimane), colonie a marrone a nere (P. intermedia, P. nigrescens) Saccarolitici La identificazione delle diverse specie pigmentate è fastidiosa perché richiedono tempi lunghi di incubazione, fino a 3 settimane per evidenziare la pigmentazione.

Bacilli Gram- negativi anaerobi asporigeni Fusobacterium Presenti normalmente nel tratto gastrointestinale, genito-urinario, nelle alte vie respiratorie e nel cavo orale, possono causare serie infezioni in diversi distretti corporei (batteriemie, inf. pleuropolmonari) Si differenziano dalle specie Prevotella, Porphyromonas e Bacteroides perché il principale prodotto metabolico è l’acido butirrico. Le specie più comunemente isolate dal materiale patologico sono: F. nucleatum e F. necrophorum Caratteristiche microscopiche Cellule fusate con l‘aspetto di filamenti sottili con estremità appuntite e talvolta rigonfiamenti sferici. Caratteristiche colturali Colonie di 1- 2 mm di diametro, convesse,con margini irregolari ed opalescenza maculata. Spesso inattivo biochimicamente. Entrambe le specie sono indolo +, esculina + ma si differenziano per la lipasi (+ F. necrophorum, - F. nucleatum).

Meccanismi patogenetici di F. nucleatum Meccanismi di invasione F. nucleatum aderisce alle cellule epiteliali orali umane, al collageno, ai fibroblasti gengivali e ai leucociti polimorfonucleati. Il LPS di F. nucleatum gioca un ruolo nell’adesione all’epitelio ed alla superficie dentale. Coaggregazione batterica La coaggregazione è definita come il riconoscimento e l’adesione di batteri geneticamente distinti, ed è un processo altamente specifico che comprende l’interazione di adesine batteriche e recettori. Differenti componenti di superficie (carboidrati, fibrille, fimbrie e proteine di membrana) possono partecipare alle reazioni di coaggregazione. La coaggregazione è un fenomeno prevalente tra i batteri isolati dal cavo orale dell’uomo ed i fusobatteri agiscono come ponte tra i primi e gli ultimi colonizzatori.

Porphyromonas gingivalis Prevotella intermedia Fusobacterium nucleatum Infezioni orofaringe Porphyromonas gingivalis Prevotella intermedia Fusobacterium nucleatum Infezioni polmonari

Bacilli anaerobi Gram- positivi asporigeni Sono un gruppo eterogeneo di batteri che colonizzano pelle e superfici mucose. Di interesse clinico: Actinomyces (A. israelii) Bifidobacterium Eubacterium (E. lentum: ferite e ascessi) Propionibacterium (P. acnes: endocarditi, inf. SNC) Identificazione L’esame colturale non è valido perché la morfologia delle cellule varia in base al terreno ed alle condizioni di crescita quindi possono essere confusi con altri anaerobi (Clostridium, Lactobacillus). Anche la colorazione di Gram non dà informazioni chiare in quanto colonie giovani possono assumere l’aspetto di cocchi, alcuni peptostreptococchi possono assumere l’aspetto di bacilli, colonie vecchie possono risultare Gram-negative, alcuni Clostridi da colture vecchie non presentano spore. Quindi per l’identificazione dei bacilli Gram positivi anaerobi sporigeni è di grande aiuto l’uso della GAS-CROMATOGRAFIA.

Actinomyces spp. Sono microrganismi anaerobi facoltativi, crescono lentamente in coltura e tendono a causare infezioni croniche. Caratteristiche microscopiche: In coltura assumono forme filamentose, dette ife, simili a quelle dei funghi (da qui il nome). Caratteristiche colturali: Le colonie macroscopiche sono chiamate “granuli di zolfo”, per il loro aspetto, e sono formate da microrganismi filamentosi legati insieme da fosfato di calcio. Sul terreno di coltura le colonie appaiono bianche, con superficie a cupola irregolare (molare). Habitat: Colonizzano il tratto respiratorio superiore, il tratto gastrointestinale, il tratto genitale femminile. Patologia: Hanno un basso potenziale di virulenza e causano malattia solo quando le barriere mucose sono lesionate da traumi, interventi chirurgici o infezioni. La malattia più comune è l’actinomicosi, caratterizzata da ascessi multipli, mentre le malattie parodontali sono più rare. Le actinomicosi sono classificate in base agli organi coinvolti in: - Inf. cervicofacciali - Inf. pelviche - Inf. toraciche - Inf. SNC Diagnosi: va effettuata su una grande quantità di tessuto o di pus, e mira alla ricerca e all’eventuale osservazione dei granuli di zolfo e di bacilli Gram-positivi filamentosi e ramificati. Terapia: Drenaggio chirurgico del tessuto + somministrazione

Cocchi anaerobi I cocchi anaerobi occupano il secondo posto (dopo i bacilli anaerobi Gram-negativi) nelle infezioni umane da anaerobi. Si possono isolare da: emocolture liquidi biologici campioni da ferite e ascessi Le specie più frequentemente coinvolte sono: Cocchi Gram-positivi Peptostreptococcus (anaerobius, asaccharoliticus, magnus, micros) Peptococcus niger Streptococcus (S. intermedius, S. morbillorum) Staphylococcus saccharolyticus Cocchi Gram-negativi Veillonella parvula Acidominococcus fermentans Megasphaera elsdenii

Principali meccanismi di antibiotico-resistenza dei batteri anaerobi Antibiotici Meccanismi di resistenza BETA-LATTAMICI Inattivazione enzimatica (beta-lattamasi) Diminuita permeabilità Alterazione del sito bersaglio (PBPs) Carbapenemici (metallo-beta-lattamasi) MACROLIDI CLINDAMICINA Alterazione del sito bersaglio (resistenza MLS) (metilazione subunità 23S rRNA) METRONIDAZOLO Alterata permeabilità CHINOLONI Alterazione dei siti bersaglio (girasi e topoisomerasi IV) Pompe d’efflusso