il riconoscimento citoplasmatico del pericolo RLH e NLR: il riconoscimento citoplasmatico del pericolo

DAMP: Damage Associated Molecular Patterns (Alarmins) DAMP: Damage Associated Molecular Patterns

Come DC, Macrofagi e mastociti “sentono” il pericolo…

RLH (RIG-I like helicases) retinoic acid inducible gene I MDA5 melanoma differentiation associated gene 5 LGP2 laboratory of genetics and physiology 2 Riconoscimento di virus a RNA Fino a 13 alpha 1 beta Omega epsilon kappa Produzione di IFN di tipo I Risposta immunitaria anti-virale (apoptosi di cells infettate, resistenza antivirale, prodiuzione RLH, attivazione NK & T cells)

RIG-I: riconoscimento di ssRNA 5’ppp Caspase Recruitment domain DExD/H-containing RNA helicases N-term -> CARD C-term -> RD RIG-I: riconoscimento di ssRNA 5’ppp MDA5: riconoscimento di dsRNA (poly I:C) LGP2: inibitore dei RLH, funzione fisiologica?

Come si attiva RIG-I?

CTD --> C terminal domain, corrisponde a Repressor Domain CTD --> contiene il dominio di riconoscimento dell’RNA In presenza ATP --> cambio conformazione helicasi --> rilascio di CARD --> interazioni con RIG-I/IPS

CARD dominio responsabile della cascata di trasduz. IPS (IFN promoter stimulator 1) o CARDIF TRAF3 (E3 ubiquitin ligasi) IKK-related kinasi: TBK-1 & IKKi Fosforilaz IRFs e formaz omo/etero dim ISRE (IFN-I stimulated response element)

NLR (NOD-Like Receptors): i NOD & l’INFLAMMOSOMA 3 DOMINI: LRR --> riconoscimento ligando NACHT -> oligomerizzazione CARD/PYD/… --> reclutamento

NOD1 & NOD2 PEPTIDOGLICANO Cosa riconoscono… - PGN: componente parete batteri GRAM+ e GRAM- Polimero di glicani che alterna N-acetiglucosamina (NAG) e acido N-acetilmuramico (NAM) I polimeri NAM-NAG sono collegati da ponti peptidici

GRAM negative: Acido meso-diapinopimelico GRAM postive: Lysina

Come PGN entra in ocntatto coi NODs? Batteri intracellulari con ciclo replicativo nel citosol: LISTERIA, SHIGELLA accesibilità DIRETTA Batteri intracellulari che restano in fagosomi: SALMONELLA, MYCOBATTERIO Batteri estracellulari TRASOPRTATORI per muramildipeptide: CD14, PepT1, PepT2

Riconoscimento dell’Ag --> cambio conformazionale --> oligomerizzazione via NACHT --> reclutamento di RICK (RIP2) via CARD Ubiquitinazione di RIP2 via TRAF (2/5; 6) --> reclutamento di TAK1 --> formazione del complesso TAK1/TAB1/2/3

Il complesso TAK1/TAB1/2/3 induce sia l’attivazione di AP1 che del complesso IKK,b, che porta all’attivazione di NFkB TAK1 e RIP2 portano anche all’attivazione di CARD9 e alla conseguente attivazione di p38

Mutazioni in NODs NOD2 --> frame-shift, induce NOD2 senza LRR terminale (no detection di PGN): MALATTIA DI CHRON, infiammazione aberrante a lvl intestinale, probabilm dovuta a mancata risposta a lvl delle mucose con conseguente induzione di risposta anti-batterica sistemica NOD1 --> mutazioni associate a ASMA, eczema atopico, …

L’INFLAMMOSOMA LRR --> per riconscimento ligando NOD/NACHT --> per multimerizzazione CARD o PYD --> reclutamento caspasi

Ruolo dell’attivazione dell’INFLAMMOSOMA Attivazione della CASPASI-1 Trasformazione di pro-IL-1 e pro-IL-18 in IL-1 e IL-18

Attivazione della cascata infiammatoria IL-1 e IL-18 Attivazione della cascata infiammatoria Effetto su cells immunità innata e sui tessuti BLOCCO diffusione patogeno

IL-1 IL-1 media numerose funzioni: Attivazione cells endoteliali Produzione IL-6 Shock endotossico indotto da LPS Attivazione linfociti

Doppia regolazione per la secrezione di IL-1 attiva: Proprio per i sui effetti pleiotropici la produzione di IL-1 deve finemente regolata La produzione deregolata o eccessiva di IL-1 può causare danno tissutale (tossicità a lvl isole pancreas e neuroni) e patologie infiammatorie Doppia regolazione per la secrezione di IL-1 attiva: Via PAMP e TLR viene indotta la sintesi del trascritto della pro-IL-1 Un secondo segnale -INFLAMMOSOMA- induce il taglio proteolitico della pro-IL-1 a IL-1

IL18: ruolo fondamentale nell’attivazione delle cellule NK In vitro exps: NK cells BM-DCs wt/KO spleen DC-NK cell coculture ELISA for IFN-γ wt/KO bone marrow Y LPS recombinant cytokines neutralizing Abs O.N. GM-CSF

IL18: ruolo fondamentale nell’attivazione delle cellule NK In vivo exps: ifnb-/-, il18-/-, il2-/-,tlr4-/- B6 or WT 100% GFP-DOG Double transgenic B6: Ub-GFP DOG (CD11c promoter-DTR) 10-day DT treatment 20% 80% Mixed BM chimera ICS for IFN-γ CD11chi DCs NK cells/BM cells - 20% KO 80% GFP-DOG 100% KO >20% KO <80% GFP-DOG Lethally irradiated A, Mixed BM chimera experimental design. B, ICS for IFN gamma: 5h after LPS injection, spleens were collected and NK cell analyzed for their capacity to produce IFN gamma.

L’inflammosoma è una PIATTAFORMA di proteine il cui assemblaggio porta all’attivazione della CASPASI in grado di tagliare le pro-IL a dare le interleukine funzionali La base di questa piattaforma è data dai NLR (14 NALP + Ipaf + NAIP)

NALP3 INFLAMMOSOMA

L’attivazione dell’inflammosoma porta alla attivazione della CASPASI-1 o ICE (IL-1 Converting Enzyme). ICE è il prototipo delle CASPASI INFIAMMATORIE. Caspasi proinfiammatorie: CASPASI 1, 4 e 5 in uomo CASPASI 1, 11 e 12 in topo Unico substrato noto: IL-1 e IL-18 per ICE Quando WESTERN BLOT ha permesso di distinguere pro-IL-1 (31kD) e IL-1 (17kD) da estratti frazionati di monociti umani in grado di indurre qto processo è stata isolata ICE

Caspasi-11 (topo) e 4/5 (uomo): Topi resistenti a shock settico (Caspasi-1!!!) Attivatore a monte di caspasi 1 Caspasi-12: Selezione positiva durante evoluzione di una forma di caspasi-12 troncata in dominio CARD Topi ko hanno migliore clearance dei batteri e maggiori lvl di IL-1, IL-6 IPOTESI: decoy caspasi che controbilancia effetti caspasi-1

CASPASI --> Cysteine proteasi che tagliano dopo un acido aspartico originariamente scoperte nell’attivazione del porcesso apoptotico Tutte le caspasi esistono come zymogeni Le caspasi “esecutive” sono le capsasi-3, -6 e -7 che sono attivate da caspasi “iniziatrici” (2, 8, 9, 10) e che inducono l’attivazione del processo APOPTOTICO. Per essere attivate qte caspasi devono essere assemblate su una piattaforma che utilizza la porteina Apaf che ha tre domini: CARD per reclutare capsasi-9 NB-ARC per oligomerizzare WD repeat per sentire il rilascio del citocromo C dai mitocondri

CASPASI INFIAMMATORIE attivate da NLR. Tre gruppi principali di INFLAMMOSOMI: BIR repeats --> caspase inhibitor

Cosa induce l’attivazione di NALP:

Antrace LeTx --> azione su NALP1 (topi ko resistenti) Forse no Pyd (--> ASC) utilizzato MA CARD-CARDINAL

PATOLOGIE ASSOCIATE A DEREGOLAZIONE NELLA PRODUZIONE DI IL-1 CRIOPIRINOPATIE: Sottofamiglia di sindrome febbrile periodica ereitaria (SFPE), caratterizzata da ricorrenti fenomeni febbrili inspiegabili e processi infiammatori molto forti. NO segni autoimmunità (auto-Ab/T autoreative) Mutazione MISSENSO in NACHT di NALP3 --> GAIN OF FUNCTION --> alti livelli di IL-1 --> Pazienti rispondono a trattam con IL-1Ra MALATTIE AUTOINFIAMMATORIE FMF E PAPA: 2 patologie dovute ad alterazione dominio PYR di NALP3.

GOTTA: Alterazione del metabolismo delle purine --> formazione di cristalli di acido urico (MSU) nelle genture --> attivazione NALP3 --> pazienti rispondono a IL1Ra VITILIGINE: Depigmentazione della pelle per assenza porgressiva melanociti. Associazioni genetiche a locus NALP1 Mutaz attivatoria --> maggiore IL1 --> aumentata attivazione T cells --> cloni T autoreattivi