TOLLERANZA IMMUNOLOGICA NELLA PRATICA CLINICA DEI TRAPIANTI DI ORGANO UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI MILANO Facoltà di Medicina e Chirurgia Scuola di Specializzazione in Biochimica Clinica TOLLERANZA IMMUNOLOGICA NELLA PRATICA CLINICA DEI TRAPIANTI DI ORGANO Gagliardi Barbara

LE BARRIERE DEL TRAPIANTO AUTOTRAPIANTO ISOTRAPIANTO Trapianto clinico Organo trapiantato Esempi di malattia Rene Cuore Polmone Fegato Cornea Pancreas o isole Midollo osseo Intestino tenue Cute Insufficienza renale terminale Insufficienza cardiaca terminale Ipertensione polmonare/Fibrosi cistica Cirrosi, cancro Distrofia, cheratiti Diabete Immunodeficienze, leucemie Cancro Ustioni ALLOTRAPIANTO XENOTRAPIANTO

UN PO’ DI STORIA… Nel 1943 Medawar e Gibson scoprirono che il rigetto tissutale è mediato dalle cellule del sistema immune Nel 1953 Billingham, Brent e Medawar dimostrarono sperimentalmente che la compresenza di cellule- leucociti di donatore e ricevente determinava l’assenza di rigetto verso i tessuti del ceppo del ricevente ma non verso i tessuti di altri ceppi “sistema HLA” Nel 1959, Murray effettua il primo trapianto di rene nell’uomo, donato da un fratello (gemello), dopo una Total Body Irradiation (TBI) Nel corso del 1960 si aggiunsero i primi interventi di fegato (Starzl 1967), cuore (Barnard 1968), midollo osseo (1968) e l’utilizzo di Azatioprina e steroidi Negli anni ‘70 si arriva alla scoperta ed uso della Ciclosporina A Permettere la TOLLERANZA SPECIFICA di un organo da parte di un sistema immune diverso

LE LEGGI DEL TRAPIANTO MHCa MHCb 50 100 10 20 50 100 10 20 Trapianto di cute in un ricevente SINGENICO Trapianto di cute in un ricevente ALLOGENICO Secondo trapianto di cute dallo STESSO DONATORE Percentuale di sopravvivenza dei trapianti MHCb non immunizzato MHCb sensibilizzato contro MHCa Il trasferimento di cellule T accelera il rigetto da un donatore sensibilizzato a un ricevente non immunizzato Giorni dopo il trapianto Trapianto di cute in un ricevente SINGENICO Trapianto di cute in un ricevente ALLOGENICO Trapianto di cute in un ricevente INCOMPATIBILE per un antigene MINORE Giorni dopo il trapianto MHCa MHCb 50 100 60 120 Percentuale di sopravvivenza dei trapianti 10

PRESENTAZIONE DEGLI ALLOANTIGENI DEL TRAPIANTO AI LINFOCITI T DEL RICEVENTE Le APC del donatore migrano verso il linfonodo e stimolano le cellule T alloreattive del ricevente Le APC del ricevente processano proteine e presentano peptidi derivati dal trapianto ALLORICONOSCIMENTO DIRETTO ALLORICONOSCIMENTO INDIRETTO

I LINFOCITI T E I SUOI COLLABORATORI Complemento APC Th CD4 CD8 IL-2 INF-γ IL-4 IL-5 linfotossina anticorpi attivazione citotossicità cellulo-mediata citotossicità cellulare anticorpo-dipendente danno litico occlusione vascolare mediatori dell’infiammazione cellule trapiantate EFFETTI SUL TRAPIANTO

I MECCANISMI DELLA TOLLERANZA PERIFERICA ANERGIA CLONALE il riconoscimento da parte di linfociti attivati dall’antigene allogenico presentato da APC in assenza di segnale costimolatorio renderà i linfociti incapaci di rispondere a quell’antigene ACTIVATION-INDUCED CELL DEATH (AICD) viene iniziato dall’IL2 e richiede l’espressione del recettore Fas-ligand sulle cellule T attivate che successivamente vengono indotte all’apoptosi SVILUPPO DI LINFOCITI T, PROGENITORI MIELOIDI O CELLULE DERIVATE DALLO STROMA CON FUNZIONE DI REGOLATORI O SOPPRESSORI i linfociti T regolatori sono capaci di inibizione allo-specifica grazie al rilascio di citochine (TGF-β o IL-10); i progenitori mieloidi CD34 a seconda che esprimano il CD86, funzionano come potenti APC, in gardo di polarizzare i linfociti T e B verso un pattern più o meno immunogenico di risposta verso alloantigeni; cellule derivate dallo stroma del midollo osseo (cheratinociti e cellule endoteliali), mancando di attivitò costimolatoria, potrebbero avere un ruolo indiretto nell’indurre tolleranza nelle cellule T

I TEMPI DEL RIGETTO TIPO DI RIGETTO TEMPO NECESSARIO CAUSA Iperacuto minuti-ore anticorpi anti-donatore preformati e complemento Accellerato giorni riattivazione di linfociti T sensibilizzati Acuto giorni-settimane attivazione primaria dei linfociti T Cronico mesi-anni cause poco chiare: anticorpi, immunocomplessi, reazioni cellulari lente, ricaduta della malattia

MALATTIA DA REAZIONE DEL TRAPIANTO CONTRO L’OSPITE (GVHD) LE ALLOREAZIONI NEL RIGETTO DEI TRAPIANTI Nel TRAPIANTO di RENE le cellule T del RICEVENTE attaccano l’ORGANO TRAPIANTATO Nel TRAPIANTO di MIDOLLO OSSEO le cellule T del TESSUTO TRAPIANTATO attaccano i tessuti del RICEVENTE midollo osseo MALATTIA DA REAZIONE DEL TRAPIANTO CONTRO L’OSPITE (GVHD) RIGETTO DEL TRAPIANTO

Trasformazione e proliferazione PREVENZIONE DEL RIGETTO TIPIZZAZIONE TISSUTALE METODO SIEROLOGICO (2-3h) complemento HLA-B8 anti HLA-B8 tripan blue La morte delle cellule conferma che queste esprimono l’antigene in questione. REAZIONE LINFOCITARIA MISTA (4-5gg) 3 7 T 4 b4 B cellula test DR4,7 cellula test DR3,7 cellula tipizzante DR4,4 nessun riconoscimento riconoscimento Trasformazione e proliferazione Nessuna reazione Le cellule DR3,7 riconoscono le cellule tipizzanti come estranee e ciò viene rivelato dalle celle test in fase di trasformazione e proliferazione; al contrario le cellule DR4,7, che presentano la specificità delle cellule tipizzanti, non riconoscono queste ultime e quindi non reagiscono ad esse.

PREVENZIONE DEL RIGETTO IMMUNOSOPPRESSIONE CON FARMACI FARMACI IN GRADO DI INATTIVARE SOLO QUEI CLONI LINFOCITARI CHE SONO SPECIFICI PER GLI ANTIGENI DEL DONATORE, LASCIANDO INALTERATI GLI ALTRI CLONI AZATIOPRINA ASPECIFICA Diminuisce o abolisce l’attività del sistema immunitario indipendentemente dall’antigene rendendo il ricevente estremamente vulnerabile alle infezioni. STEROIDI CICLOSPORINA Sopprimono i macrofagi attivati, diminuiscono la funzione delle APC e riducono l’espressione delle molecole MHC Sopprime la produzione di linfochine da parte dei linfociti Th Incorporandosi nel DNA delle cellule in via di divisione, ne impedisce l’ulteriore proliferazione SPECIFICA TOTAL LYMPHOID IRRADIATION (TLI) I linfociti maturi sono drasticamente eliminati tramite irradiazione, mentre il midollo osseo viene protetto e rimane intatto; questa metodica , seguita da un’esposizione all’antigene, induce una tolleranza completa ma risulta pericolosa se utilizzata abitudinariamente a scopi clinici DONOR SPECIFIC TRANSFUSION (DST) Una trasfusione di sangue del donatore somministrata per via endovenosa nel ricevente, una settimana prima del trapianto, determina un attecchimento a lungo termine dell’organo (nel 80% dei casi il successo del trapianto è del 95-100%). In alternativa, anticorpi anti-donatore , somministrati al ricevente al momento del trapianto possono causare un potenziamento passivo della sopravvivenza del trapianto.

UN OSSERVAZIONE SPERIMENTALE… Razionale: studiare la capacità delle cellule T di indurre tolleranza per sviluppare approcci di possibile applicazione clinica Il trasferimento di alloantigeni da parte di cellule T può essere usato per indurre tolleranza nei confronti di un trapianto allogenico effettuato in riceventi sottoposti a regimi di condizionamento mieloablativi e non?

Sopravvivenza di cellule T che esprimono alloantigeni in topi sottoposti a irradiazione Sopravvivenza di cellule T che esprimono alloantigeni in topi sottoposti a condizionamento non-mieloablativo La tolleranza indotta attraverso il trasferimento di cellule T mature ha evitato il rigetto cronico del trapianto di cuore Topi sottoposti a trapianto di cuore che non hanno ricevuto cellule T hanno rigettato il trapianto (infiltrato di cellule T CD3+ e cellule B B220+) Il trapianto di cuore in topi riceventi che sono stati sottoposti a trasferimento di cellule T dopo condizionamento mieloablativo non presenta segni di infiltrati cellulari Il trapianto di cuore è stato ben accettato anche in topi riceventi sottoposti a trasferimento di cellule T dopo condizionamento non-mieloablativo

La tolleranza indotta mediante il trasferimento di cellule T mature determina una diminuzione nel siero dei livelli di citochine pro-infiammatorie La concentrazione di IFN-γ, IL-15, IL-9, IL-1α e IL-1β è significativamente più bassa nel siero di topi che hanno ricevuto cellule T (istogramma bianco) rispetto a quelle delle stesse citochine misurate nel siero di topi che non hanno ricevuto cellule T (istogramma nero) Il trasferimento di cellule T mature ha causato la delezione centrale delle cellule T alloreattive Il trasferimento di cellule T mature aumenta la frequenza di cellule T con funzioni regolatorie La frequenza di cellule CD4+ e CD8+ esprimenti Vβ3 era significativamente ridotta in topi riceventi cellule T (istogramma bianco) rispetto a topi controllo non riceventi cellule T (istogramma nero). Scarsa presenza di infiltrati cellulari nel trapianto di topi sottoposti a condizionamento mieloablativo e scarsa presenza di cellule positive per FoxP3 rispetto ad un abbondante presenza delle stesse cellule osservata nel trapianto di topi sottoposti a condizionamento non-mieloablativo

CONCLUSIONI Il trasferimento di cellule T mature in topi sottoposti a regimi di condizionamento non-mieloablativi determina uno stato di tolleranza a lungo termine. Il trapianto di un organo solido in topi riceventi è stato tollerato indefinitamente. L’istologia dell’organo trapiantato non ha mostrato i segni caratteristici del rigetto cronico. Non sono state osservati aumenti nei livelli sistemici di citochine proinfiammatorie associate allo sviluppo del rigetto cronico come IFN-γ, IL-1α e IL-1β. IL TRASFERIMENTO DI CELLULE T MATURE INDUCE TOLLERANZA NEI CONFRONTI DI ALLOANTIGENI MHC DI CLASSE I E DI CLASSE II Sia gli antigeni di superficie che quelli intracellulari trasportati nel timo dalle cellule T mature sono coinvolti nei fenomeni di selezione negativa, ma solo parzialmente. NELL’INDUZIONE DELLA TOLLERANZA OLTRE ALLA DELEZIONE CENTRALE GIOCANO UN RUOLO IMPORTANTE ANCHE LA REGOLAZIONE IN PERIFERIA DELLE RISPOSTE MEDIATE DALLE CELLULE T Cellule del donatore Foxp3+ sono più abbondanti rispetto a cellule naive nel sangue periferico dei riceventi. Cellule esprimenti Foxp3 si osservano nell’organo trapiantato di topi riceventi il trasferimento di cellule T mature. LE CELLULE T ALLOGENICHE MATURE SONO CAPACI DI INDURRE E MANTENERE LA TOLLERANZA NEI CONFRONTI DEL CUORE TRAPIANTATO

CONCLUSIONI Il traguardo della tolleranza immunologica può essere raggiunto non solo tramite farmaci immunosoppressori con lo scopo di ridurre o abolire il rigetto ma soprattutto tramite la manipolazione biologica di cellule e/o molecole capaci di indurre selettivamente uno stato di non responsività antigene specifica. Nel trapianto di organi l’obbiettivo da raggiungere deve essere l’attecchimento dell’organo in uno stato di “donor-specific T cell unresponsiveness” mediante la produzione di un microchimerismo donatore-ricevente. Nonostante i regimi di pretrattamento, la comparsa del rigetto acuto è un evento clinico quasi ineludibile; tuttavia quasi sempre è dominabile con in normali mezzi terapeutici, permettendo in ogni caso il ritorno ad una situazione di “minimizzazione dell’immunosoppressione” che non interferisce con il raggiungimento e mantenimento di un alto grado di “donor-specific nonreactivity” Molte esperienze cliniche hanno confermato, se non la possibilità di lasciare completamente senza immunosoppressione il ricevente, di indurre uno stato di quasi tolleranza con la quale diminuire il pericolo, nel lungo periodo, di effetti tossici.